تهیه ژل آگارز برای الکتروفورز

[masi eng 47,044]

روش تهیه ژل آگارز :

 

در تهیه ژل آگارز از بافر و پودر آگارز استفاده می شود. نسبت این دو بستگی مستقیمی به اندازه DNA یا مولکول هایی که قرار است الکتروفورز شوند دارند.

جدول زیر درصد غلظت ژل تهیه شده برای قطعات مختلف DNA را نشان می دهد:

 

 

برای تهیه ژل آگارز ، معمولا پودر آگارز را در یک بافر مناسب حل می کنند؛ از جمله بافرهایی که برای این کار استفاده می شوند TAE و TBE را می توان نام برد. بافر TAE از تریس ، استیک اسید و EDTA تشکیل شده است و برای تنظیم اسیدیته محیط به کار می رودو غلظت آن در ژل و تانک الکتروفورز باید یکسان باشد تا حین برقراری جریان الکتریکی، تعادل یونی بین ژل و بافر تانک ایجاد شده و اختلالی در حرکت نمونه های DNA رخ ندهد. در بافر TBE به جای استیک اسید از اسید بوریک استفاده می شود.

باید نسبت بافر و پودر آگارز به گونه ای باشد که درصد آگارز مورد نظر را ایجاد کند؛ بافر معمولا در غلظت های 1x، 5x ، 10x و ... تهیه می شود. اگر به طور مثال هدف تهیه ژل 2 درصد آگارز است و برای این کار از بافر 5x استفاده می شود ، باید در هر 10 میلی لیتر بافر ، 1 گرم آگارز ریخته شود. ( از ضرب میزان حجم بافر در غلظت آن به عدد 50 می رسیم که با ضرب آن در 2 درصد یا با بستن یک تناسب ساده به این نتیجه می رسیم که باید از 1 گرم آگارز استفاده شود. )

در اینجا دستور تهیه ژل آگارز 1 درصد در حجم 50 میلی لیتر آورده شده است.

* قبل از تهیه ژل باید در نظر داشت که سینی مخصوص ژل را آماده کرده و شانه مخصوص را در آن قرار دهیم.

- پور آگارز و بافر را در با نسبت های معین و محاسبه شده با هم مخلوط می کنیم. در این آزمایش برای تهیه ژل 1 درصد و با داشتن بافر 5x ، 10 میلی لیتر از بافر را با 0.5 گرم آگارز مخلوط کرده و سپس ارلن مخلوط را روی حرارت قرار میدهیم . حین حرارت دیدن باید مخلوط را هم زد تا پودر آگارز رسوب نکند و نسوزد.

- با به جوش آمدن مخلوط یا به محض شفاف شدن آن (حل شدن پودر آگارز) آن را از روی حرارت برداشته و ارلن را در محیط آزمایشگاه قرار می دهیم تا مواد کمی از دما بیفتند.

* اگر بلافاصله بعد از برداشتن از روی حرارت ژل را در سینی بریزیم، سرعت سرد شدن آن در سینی باعث می شود اندازه ذرات کوچک شده و منافذی که برای ژلی با این غلظت انتظار می رود ، تشکیل نگردد.

- وقتی دمای ژل به 50 تا 60 درجه رسید آن را به سینی مخصوص ژل منتقل می کنیم؛ باید دقت شود که این کار به آهستگی و به طور یکنواخت انجام شود تا حبابی در ژل ایجاد نشود. در صورت ایجاد حباب نیز باید آن را با سر سمپلر یا هر وسیله مناسب و تمیز دیگری از بین برد.

- بعد از بستن ژل ، آن را با سینی به ظرف تانک منتقل نموده و برای انجام عمل الکتروفورز استفاده می کنیم.

دانشكده بيوتكنولوژي مشهد