نمونه سوالات امتحانی آزمایشگاه میکروبیولوژی عمومی

[Mahdi Eng 22,940]

1– معمولترین محیط کشت میکروارگانیسمها چیست و از چه موادی ساخته می شود؟

معمولترین محیط کشت میکروارگانیسمها محیط غذایی است که حاوی عصاره گوشت و پیتون می باشد. برای تهیه عصاره گوشت، گوشت بدون چربی گاو را در آب بجوشانید و بعد با تبخیر آن را به صورت چسب درآورید. مواد تشکیل دهنده عصاره گوشت از محصولات مختلفی تشکیل یافته که در اثر تجزیه پروتئینها حاصل می شود.

 

2– آگار چیست؟ خواص آن را شرح دهید؟

هنگامیکه بخواهیم باکتریها را روی یک محیط کشت جامد رشد دهیم معمولاً از یک واسطه جامد کننده به نام آگار در محیط کشت استفاده می شود. آگار یک پلی ساکارید پیچیده است که از یک جلبک دریایی گرفته شده است و به عنوان یک قوام دهنده ژله ، بستنی و ... مدتهای طولانی مورد استفاده بوده است، با خواص مهمی که دارد برای میکروبیولوژی باارزش است. تعداد کمی از باکتریها می توانند آگار را تجزیه و فاسد کنند بنابراین آگار جامد باقی می ماند.

 

3- طرز تهیه و آماده سازی محیط های کشت پودری موجود در بازار را بنویسید؟

در مواردی که محیط کشت مورد نظر به صورت پودر است به اندازه مناسب از آن وزن نموده، در داخل ارلن بریزید و بعد از افزودن آب مقطر به اندازه تعیین شده و حل کردن محیط کشت و قرار دادن در پیچ و یا در پوش پنبه ای و بستن دهانه آن با کاغذ آلومینیومی، ارلن را داخل ارتوکلاو قرار دهید و در حرات 121 درجه سلسیوس و فشار 15 پوند بر اینچ آن را برای مدت 15 دقیقه استریل نمائید. در مرحله بعدی پتری ویش و ظرف کشتهای استریل شده 15 پوند بر اینچ آن را برای مدت 15 دقیقه استریل نمائید. در مرحله بعدی پتری ویش و ظرف کشتهای استریل شده را که مورد نیاز هستند از آون خارج نموده، داخل لوله فلزی پوششی یا کاغذ آلومینیومی باقی بگذارید تا سرد شوند. میز کار را با پارچه تمیز نموده، با پنبه الکلی آلودگی سطح آن را پاک نمائید. بعد از چیدن پتری ویشها بر روی فیبر و نوشتن نام محیط کشت بر روی درب آنها با بلند کردن دربشان در هر کدام به اندازه ای که تمام سطح پتری ویش را بپوشاند از محلول محیط کشت ریخته، سپس درب آنها را برای مدتی به حالت زاویه دار روی لبه آنها قرار دهید. بعد از افزودن مواد محیط کشت به تمام پتری ویشها، درب آنها را به حالت اول بازگردانید تا از ورود میکروبها به داخل پتری دیشها جلوگیری شود. پس از سرد شدن و بسته شدن محلول محیط کشت، آنها را داخل یخچال قرار دهید تا بعداً مورد استفاده قرار گیرند.

 

4– محیط کشت را تعریف کنید و انواع آن را نام ببرید؟

برای هر یک از میکروارگانیسم ها باید مخلوطی متعادل از غذاهای مورد نیاز ، به غلظتی تهیه گردد که رشد موجود در آن بخوبی صورت گیرد.چنین مخلوطی را محیط کشت گویند.

1 – محیط های کشت ساده

2 – محیط های کشت پیچیده

3 – محیط های تشخیصی یا متمایز کننده

 

5– محیط کشت ساده را تعریف کنید؟

این محیط به نحوی گزینش می شوند که بتوانند مواد مغذی لازم برای رشد و نمو تمام میکروارگانیسمهای آلوده کننده را فراهم سازند. مهمترین نمونه های این نوع محیط کشت Nutnient agar جامد و Nutrient broth مایع است که بیشتر برای شمارش تعداد میکروارگانیسمهای آلوده کننده مواد غذایی بکار می روند.

 

6- روشهای کشت میکروارگانیسمها را نام ببرید؟

1 – کشت میکروارگانیسمهای هوازی

2 – کشت بی هوازی باکتریها

3 – کشت بی هوازی باکتریها با استفاده از دیسکاتور

4 – روش شمارش مستقیم

 

7– روش کشت پورپلیت را برای شمارش میکروارگانیسمها توضیح دهید؟

در روش پورپلیت با توجه به رقتهای مختلف تهیه شده از نمونه غذایی برای هر رقت 2 تا 4 ظرف پتری اختصاص داده می شود و یک ظرف نیز به عنوان کنترل برای اطمینان از سترون بودن روف پتری و محیط کشت در نظر گرفته می شود. روی ظروف پتری را با شماره نمونه، رقت و تاریخ آزمایش مشخص کرده، در هر دو یا چهار ظرف پتری از رقت مربوط ، یک میلی لیتر قرار می دهند به این ترتیب با استفاده از یک پیپت، کلیه رقتها به ظروف پتری منتقل می شوند، محیط کشت مناسب قبلاً ذوب و در حمام مادی 45 درجه سانتیگراد نگهداری می شود پس از ریختن رقتهای مختلف ماده غذایی به داخل ظروف پتری به هر ظرف حدود 15 میلی لیتر از محیط کشت مذاب که حرارت آن بیشتر از 45 درجه نباشد اضافه می شود . پس از آن بلافاصله در ظرف را بسته، آن را 15 بار از عقب به جلو، 5 بار در جهت عقربه های ساعت، 5 بار از چپ به راست و 5 بار خلاف عقربه های ساعت به آرامی حرکت می دهند تا نمونه و محیط کشت بخوبی مخلوط شوند.

کمی صبر کنید تا محیط کاملاً ببندد و بعد، از میحط مذاب که همچنان در حمام بن ماری نگهداری شده مقدار کمی روی هر ظرف پتری می ریزند به طوری که لایه نازکی از محیط سطح ظرف پتری را بپوشاند. در نتیجه این عمل از آلوده شدن سطحی جلوگیری می شود و همچنین تا اندازه ای شرایط بی هوازی برای نشان دادن حالات تخمیری برخی از باکتریها ایجاد می گردد. پس از بسته شدن لایه دوم ظروف پتری را به طور واژگون در گرمخانه با توجه به حرارت مناسب رشد باکتری مربوط قرار می دهند. کشتها را مدت 24 ساعت در گرمخانه نگهداری می کنند و پس از این مدت به کمک دستگاه پرگنه شمار، پرگنه های ظاهر شده در ظروف پتری را که بین 300 – 30 پرگنه دارند می شمارند. مجدداً 24 ساعت دیگر ظروف را در گرمخانه قرار داده، پس از این مدت یک بار دیگر نیز تعداد پرگنه ها را می شمارند. میانگین تعداد پرگنه های شمارش شده در دو یا چهارظرف پتری با در نظر گرفتن رقت آن تعداد میکروارگانیسمهای موجود در ماده غذایی را تعیین می کند.

 

8- روش کشت سطحی را برای شمارش میکروارگانیسمها توضیح دهید؟

در این روش باید ظروف پتری حاوی محیط کشت قبلاً تهیه شده باشند و سطح محیط با قراردادن آنها در گرمخاه 55 -50 درجه سلسیوس به مدت نیم تا دو ساعت خشم شود. در این مدت باید در ظرف پتری باز و سطح محیط رو به پائین باشد. سپس با توجه به رقتهای تهیه شده، برای هر رقت 2 تا 4 ظرف پتری انتخاب نمود و یک ظرف به عنوان کنترل منفی در نظر گرفت . روی هر ظرف پتری را با شماره نمونه رقت و تاریخ کشت مشخص می کنند و پس از تهیه رقتها، از رقیق ترین آنها به کمک پیپت 1/0 میلی لیتری برداشت کرده، در سطح محیط می ریزند و بعد همان پیپت را رقت بعدی که 10 برابر بیشتر است سه بار شسته و 1/0 از آن را برداشته در ظرف پتری مربوط می ریزند. به همین ترتیب ادامه داده می شود تا آخرین رقت، سپس برای هر رقت از یک پخش کننده شیشه ای سترون استفاده کرده، نمونه را بخوبی در سطح ظرف پتری می گسترانند. نحوه حرکت میله شیشه ای یا آنس پلاتین روی سطح محیط کشت باید به گونه ای باشد که از زخمی کردن سطح محیط کشت جلوگیری کند. انجام ای کار با استفاده از میله شیشه ای سترون آسانتر می باشد.سپس ظروف پتری را مانند روش قبل با توجه به انتخاب درجه حرارت و زمان گرمخانه گذاری، مدت 24 ساعت در گرمخانه 1 35 درجه سلسیوس قرار داده، پس از 24 ساعت ظروفی را که بین 300- 30 پرگنه دارند می شمارند. مجدداً ظروف را برای 24 ساعت دیگر گرمخانه گذاری کرده، پس از آن پرگنه ها را شمارش می کنند و میانگین شمارش را بدست می آورند.

 

9– روش شمارش باکتریها با کاغذ صافی چه مزایایی دارد و بیشتر در چه مواردی به کار می رود؟

کاغذهای صافی مخصوص میکروب شناسی در صنعت ساخته شده است که به دلیل داشتن منافذ بسیار ریز، میکروبها را در خود نگه می دارند. از این کاغذ صافیها برای ستون کردن مایعات و محلولهای مختلف حساس به حرارت استفاده می شود. بعضی از کارخانه های سازنده وسایل آزمایشگاهی از این نوع کاغذها با قیفهای مخصوص که در برابر حرارت مقاوم اند و قابل سترون شدن می باشند برای شمارش و جستجوی باکتریها در آب و فرآورده های دارویی ساخته اند و حتی بعضی از سازندگان ظروف پتری مخصوص که قطر آنها متناسب با کاغذهای صافی است و محیط های کشت آماده در آمپولهای کوچک برای یکبار کشت و حتی گرمخانه های کوچک که با برق اتومبیل و یا با باتری کار می کنند برای عملیات صحرایی تهیه و عرضه کرده اند. از این صافیها برای جستجو و شمارش میکروبها در آب آشامیدنی و دیگر آشامیدنیهایی که تعداد باکتریهای آنها کم است و لازم می باشد که حجم زیادی از نمونه برای شمارش و جستجوی باکتری بکار رود استفاده می شود.

از این روش در بهداشت محیط و کنترل آب و فاضلاب و بررسیهای همه گیری شناسی بسیار ارزشمند است.

 

10– روش شمارش مستقیم را شرح دهید؟

در روش شمارش مستقیم می توان از لامهای مخصوص نئوبار و یا لام توما که معمولاً برای شمارش گلبولهای خون بکار می رود استفاده نمود. بدین ترتیب که نمونه مورد آزمایش به نسبتهای معین با آب مقطر و یا سرم فیزیولوژی و یا هر رقیق کننده مناسب دیگر، رقیق می شود. بعد از رقت تهیه شده روی لام توما ریخته، یک لامل سنگین روی آ ن قرار می دهند. چند دقیقه صبر کرده، سپس در زیر میکروسکوپ با عدسی 40 میکروارگانیسمها را در حجم معینی شمارش می کنند و با توجه به رقت نمونه – تعداد میکروارگانیسمها در هر گرم و یا سانتیمتر مکعب بدست می آید.

 

رنگ آمیزی میکروارگانیسمها

11 – مزایای رنگ آمیزی را نام ببرید؟

1 – ایجاد تضاد بین میکروارگانیسمها و زمینه آنها، که در نتیجه باعث تمایز اشکال مختلف می شود.

2 – امکان بررسی ساختمانهای داخلی سلول باکتریها، مثل دیواره سلولی، واکوئل، یا ضمائم هسته را فراهم می نماید.

3 – به باکتری شناس امکان می دهد که در درشت نمایی بیشتر استفاده کند.

 

12– ماده رنگی را تعریف کنید؟

مواد رنگی اغلب املاحی هستند که یکی از یونهای آنها رنگی است یک ملح یا نمک ترکیبی است که از یک یون با بارالکتریکی مثبت و یک یون با بار الکتریکی منفی تشکیل شده است. ماده رنگی ساده متیلن بلو در حقیقت ملح کلرو متین بلو می باشد که تجزیه آن کلرورمتیلن بلو -----> متین بلو + کلرور

 

13 – روشهای رنگ آمیزی را نام ببرید؟

الف ) رنگ آمیزیهای ساده :

1 – مواد رنگی قلیایی

2 – مواد رنگی اسیدی

3 – مواد رنگی خنثی

ب) رنگ آمیزیهای تشخیصی :

1 - رنگ آمیزی گرم

2- رنگ آمیزی اسید فست

 

14 – طرح رنگ آمیزی با رنگهای قلیایی را توضیح دهید؟

برای رنگ آمیزی رنگهای قلیایی متیلن بلو، کریستال و یوله و کربول فوشین را به بکار خواهید برد، تمام اینها رنگهای قلیایی هستند. ولی از نظر میزان و درجه رنگ کردن سلول با یکدیگر متفاوتند. متیلین بلو با بار الکتریکی منفی بکندی وارد واکنش شده، برای رنگ کردن مناسب یک نمونه میکروبی در حدود 30 تا 60 ثانیه وقت لازم دارد. کریستال ویوله دارای قدرت واکنش بیشتر است و به طور معمول برای رنگ کردن احتیاج به حدود 10 ثانیه وقت دارد.

 

15 – اساس رنگ آمیزیهای تشخیصی چیست؟

اساس رنگ آمیزیهای ساده بر این حقیقت بنا شده است که سلول باکتریها از نظر شیمیایی از محیط اطرافشان متفاوت است و بنابراین می توانند پس از رنگ آمیزی از محیط خود متمایز شوند. خود میکروارگانیسمها هم دارای اختلافات شیمیایی و فیزیکی هستند و بدین طریق در مقابل یک روش رنگ آمیزی معین واکنشهای متفاوتی نشان می دهند. این اصلی است که براساس آن رنگ آمیزیهای تشخیصی بنا شده است. رنگ آمیزی تشخیصی از این تفاوت در میزان بی رنگ شدن استفاده کرد، انواع مختلف باکتریها را از یکدیگر متمایز می کنیم.

 

16- به طور خلاصه رنگ آمیزی گرم را توضیح دهید؟

با به کار بردن این روش می توان باکتریها را به دو گروه تقسیم کرد: گرم مثبت و گرم منفی.

در رنگ آمیزی گرم چهار محلول مختلف مورد نیاز است. یک رنگ قلیایی، یک دندانه یک عامل رنگ بر و یک رنگ دوم.دندانه ماده ای است که گرایش یا جذب ماده رنگی را به سلول افزایش می دهد ، یعنی به شکلی تثبیت رنگ را در روی سلول تسهیل می کند. اسیدها، قلیائیها، املاح معدنی و ید را می توان به عنوان دندانه مثال زد. سلولی که زیر تأثیر دندانه است بیشتر و بهتر رنگ می شود عامل رنگ بر ، همانطور که از اسمش معلوم است، ماده ای است که رنگ را از یک سلول رنگ شده خارج می کند. بعضی از سلولهای رنگ شده راحتتر از سلولهای دیگر بی رنگ می شوند. در رنگ آمیزی گرم و در سایر روشهای رنگ آمیزی تشخیصی از این تفاوت در میزان بی رنگ شدن استفاده کرد، انواع مختلف باکتریها را از یکدیگر متمایز می کنیم.

 

17 – رنگ آمیزی اسید فست را توضیح دهید؟

رنگ آمیزی اسیدفست، رنگ آمیزی تشخیصی است که میزان و درجه مقاومت سلولهای رنگ شده را در برابر رنگ بری اسیدها تعیین می کند. خاصیت مقاومت در برابر اسیدها در بعضی مایکوباکتریومها و اکتیو میستها بستگی به مقدار زیادی لیپید دارد که در آنها موجود است. برای رنگ آمیزی این باکتریها حرارت و رنگی که دارای گرایش قوی به سلول ای باکتریها دارد مورد نیاز است.

این باکتریها، بعد از یک بار رنگ شدن ، به دشواری ممکن است بی رنگ شوند.در این روش از کربول فوشین گرم برای رنگ آمیزی، و از محلول اسید – الکل به عنوان عامل بی رنگ کننده استفاده و بعد هم رنگ آمیزی دوم سلول باکتریها عملی می شود. باکتریهای اسید فست ، کندتر از سایر میکروارگانیسم ها، در برابر اسید – الکل بی رنگ شده ، بعد از رنگ آمیزی دوم ، رنگ اولیه خود را حفظ می کنند.