محیط های کشت مورد استفاده در ازمایشگاه صنایع غذایی

[Mahdi Eng 22,940]

محیط های کشت

 

 

محیط های متداول در كشت میكربی و نحوه تهیه آنها :

 

مقدمه :

 

برای مطالعه میكروارگانیسم ها باید بطریقی آنها را بر روی محیطهای مناسب از نظر شرایط فیزیكی و شیمیایی كشت داد . مطالعه زیاد درباره میكروارگانیسم ها و نحوه زندگی آنها باعث شده كه تا كنون انواع زیادی از محیط كشت با تركیبات متفاوت به طور مصنوعی برای استفاده در آزمایشگاههای میكروبیولوژی تهیه شود . هرچند انواع این محیط كشت ها زیاد می باشند، معهذا در مواردی برای كشت نوع بخصوصی از یك میكروارگانیسم باید از یك نوع محیط كشت بخصوص با تركیبات مشخص استفاده شود.

طور كلی محیط های كشت باید دارای مشخصات معینی باشند و هنگام تهیه و استفاده از محیط كشتها باید به نكات زیر توجه شود :

 

تمام محیط كشتها باید واجد مواد غذایی ضروری برای رشد میكروبها باشند

PH محیط كشت باید در حد معین قبل از استفاده برای كشت تنظیم شود.

ظروف مورد استفاده برای تهیه محیط كشتها باید كاملا تمیز و عاری از مواد خارجی باشند .

آب مقطر مورد استفاده باید بطریقه صحیح تهیه شود .

درجه حرارتی كه برای استریل كردن محیط كشت مصرف می شود باید نسبت به نوع مواد غذایی مربوط در محیط كشت در نظر گرفته شود . درجات بالا باعث از بین رفتن برخی از مواد شیمیایی موجود در محیط كشت می شوند .

 

 

محیط های كشت باكتریها به سه صورت زیر تهیه میشود :

 

محیط كشت مایع یا آبگوشتی (liquid or broth media)

محیط كشت جامد (solid media)

محیط كشت نیمه جامد (semi solid media

 

 

محیط كشت مایع ( براث ) :

 

این محیط فاقد آگار و فقط در لوله آزمایش یا فلاسك استفاده میشود . مثل محیط نوترینت براث.

 

 

 

محیط كشت جامد :

 

این محیط حاوی 5/1 تا 2 درصد ماده آگار است كه بعد از سرد شدن منعقد می شود . محیط كشت جامد را درون لوله آزمایش یا پلیت استفاده می كنند.مثل محیط TSI و M.c

 

 

 

دلیل بكارگیری محیط جامد ، تشخیص باكتریها به وسیله :

 

تشكیل كلنی

تولید پیگمانت

خصوصیات خاص هر كلنی

تشخیص انواع باكتریها كه چند نوع باكتری در نمونه میكروبی وجود دارد .

موكوئیدی بودن باكتری

دیدن منطقه همولیز .

 

 

محیط كشت نیمه جامد :

 

این محیط در تركیب خود مقدار كمی آگار دارد . بنابراین كاملا منعقد نمی شود و نیمه جامد باقی می ماند . مثل محیط SIM .

 

آگار :

 

ماده ای پلی ساكاریدی است كه از یك نوع جلبك قرمز دریایی تهیه می شود، در c° 95 ذوب و در حرارت c° 42 منعقد می گردد .

 

 

محیط های كشت باكتری را از نظر نوع مواد تشكیل دهنده و از نظر كاربرد به چهار دسته تقسیم می كنند:

 

 

محیط كشت پایه (Basic Media) :

 

این محیط كمترین مقدار مواد غذایی برای رشد باكتریها را دارد . و مبنای تهیه انواع و اقسام محیطهای كشت می باشد . اكثر انواع باكتریها در آن رشد می كنند زیرا فاقد ماده ضد میكرب است . مانند محیط نوترینت آگار ، نوترینت براث .

 

محیط كشت غنی كننده (Enrichment Media) :

 

 

محیط مقوی بوده كه دارای مواد تغذیه ای زیادی نظیر ویتامین ها ، لیپید ها ، اسید های آمینه برای رشد باكتری است . بنابراین تعداد زیادی از باكتریها روی آن بخوبی رشد می كنند . مانند شكلات آگار، بلادآگار .

 

محیط كشت افتراقی (Differential Media) :

 

محیط كشت تشخیصی بوده كه كلنی باكتریهای مختلف روی آن كاملا از همدیگر متمایز می گردد. مانند محیط E.M.B ، M.c این محیطها دارای املاح صفراوی ، قند و معرف شیمیایی هستند كه باكتریهای لاكتوز مثبت برروی آنها كلنی های صورتی رنگ و باكتریهای لاكتوز منفی نظیر سالمونلا ، شیگلا بر روی این محیط ها كلنی های سفید رنگ تشكیل می دهند . از محیطهای افتراقی دیگر محیط TSI ، سیمون سیترات را میتوان نام برد . این محیط ها برای رشد باكتریهای گرم – منفی روده ای (انتروباكتریاسه) مناسب هستند . چون وجود املاح صفراوی در محیط مانع از رشد باكتریهای گرم مثبت در محیط می شوند.

 

محیط كشت اختصاصی (Special Media) :

 

این محیطها برای رشد باكتریهای خاصی مناسبند . از این محیطها برای ایزوله نوع خاصی از باكتری در یك مخلوط میكربی استفاده می شود . مانند محیط s.s آگار كه برای جدا كردن سالمونلا و شیگلا بكار میرود یا مانیتول سالت آگار كه برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوكوكوس اورئوس استفاده می شود .

 

محیط كشت انتخابی : (Selective Media )

 

محیط هایی وجود دارند كه دارای یك ماده مهار كننده رشد می باشند این مواد رشد تمام ارگانیسم ها بجز ارگانیسم مورد نظر را مهارمی كنند . درمرحله اول از رنگ هایی كه دارای خواص ضد میكروبی هستند استفاده می شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتی بیوتیك ها و مرحله آخر شامل وارد كردن مواد تركیبی به محیط كشت جهت فعالیتهای متابولیكی ارگانیسم مورد نظر می باشد . از آنجا ئیكه این محیط ها جهت ارگانیسم مورد نظر انتخاب شده اند و برای سایر ارگانیسم ها مضر می باشند آنها را محیط های انتخابی می نامند . مثالی از این نوع محیط ها ، محیط كشت فنیل اتیل الكل آگار است كه از رشد باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی اختیاری ممانعت بعمل آورده و به ارگانیسم های گرم مثبت اجازه رشد می دهد .

 

 

 

طرز تهیه كلی محیط های كشت :

 

همانطوریكه می دانید محیطهای كشت به سه دسته جامد ، نیمه جامد ، مایع تقسیم می شوند . محیطهای مایع معمولاً فاقد آگار هستند یا مقدار آگارشان بسیار كم است . مثلاً حدود ( 2/0%) و محیط های نیمه جامد دارای مقدار كمی آگار حدود 3- 2 گرم وبالاخره محیط های جامد كه دارای 15- 13 گرم آگار در لیتر محیط هستند .

 

برای ساختن محیط های كشت باكتری، ما از پودر مخصوص كه در شیشه های مربوطه قرار دارد، استفاده می‌ كنیم. در روی این شیشه ها تركیب محیط بطور كامل و همچنین طرز ساختن آن نوشته شده است . مثلاً برای ساختن نوترینت آگار ابتدا مقدار لازم از پودر آن را وزن كرده ودر مقدار معینی آب مقطر كه قبلاً در یك ارلن مایر یا بطری ریخته اید اضافی نموده و آنرا كاملاً‌ حل نمائید وسپس با پنبه درب ارلن مایر را مسدود كرده و آن را روی سه پایه چراغ گازی حرارت می‌دهید ، تا زمان جوشیدن آنرا چند بار تكان دهید تا خوب حل شود و بمدت یك دقیقه بجوشد پس از آنكه مایع بجوش آمد ، آنرا برداشته وبا تكه كاغذ آلومینیومی روی پنبه را می‌پوشانید وظرف را در اتوكلاو می‌گذارید تا در فشار 15 پاند بر اینچ مربع و حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل شود . بعد از استریل كردن بگذارید تا خنك شود تا حدود c450- 40 . سپس در حالیكه ارلن را در دست راست گرفته و پنبه آنرا با دست چپ كنار شعله خارج كرده‌اید ، دهانه ارلن را یكبار از درون شعله گاز عبور دهید وبعد درون پلیت های استریل شده بین cc20- 15 از محل محلول بریزید . بعد پلیت ها را در كناری بگذارید تا سرد شوند وازتكان دادن آن خودداری نمائید وپس از جامد شدن محیطهای كشت نوترینت آگار را جمع كرده ودر c370 بمدت 24 ساعت قرار دهید . اگر محیط ها آلوده نشده باشند آنها را از c370 بیرون آورده و در یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار می‌دهید .

 

طرز ساختن سایر محیطهای كشت، همینطور می‌باشد منتهی بعضی از محیطهای جامد در لوله مستقیم، پس از جوشاندن ریخته شده و بعد استریل می‌شوند كه این محیطها را پس از استریل شدن، به طور ایستاده می‌گذاریم مثل محیط SIM و یا كج می‌گذاریم مثل محیط TSI تا سرد شوند .

 

برای ساختن محیط مایع (براث) پس از جوشاندن، محیط را در لوله‌ ها تقسیم می‌كنیم و سپس با پنبه‌ای درب آنها را مسدود كرده و جهت استریل داخل اتوكلاو قرار می‌دهیم .

 

 

انواع محیط های كشت

 

محیط های كشت عمده ‌ای كه در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :

 

محیط نوترینت براث (Nutrient broth ):

 

این محیط مبنای ساخت اكثر محیطهای كشت است و از عصاره گوشت تهیه می‌شود طرز تهیه آن مثل نوترینت آگار می‌باشد . این محیط بدلیل نداشتن آگار بصورت مایع در لوله آزمایش تهیه می شود .

 

 

 

محیط نوترینت آگار (Nutrient agar):

 

چنانچه ماده آگار را به نسبت 5/1 تا 2 درصد با آبگوشت غذایی مخلوط كنیم، این آگار غذایی بدست می‌آید . این محیط مبنای تهیه انواع و اقسام محیط های كشت جامد مثل

برای مشاهده این محتوا لطفاً ثبت نام کنید یا وارد شوید.

• ورود
• یا
• ثبت نام

Agar , Chocolate agar می باشد .

 

 

 

محیط آگار خوندار (Blood agar) :

 

اغلب نمونه های رسیده به آزمایشگاه میكروب شناسی بر روی محیط آگار خوندار كشت داده می‌شوند، چون این محیط از رشد تمام واغلب باكتریهای سخت رشد حمایت كرده و اغلب میكروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژی كلنی بر روی آگار خوندار تصمیم گیری نمایند . این محیط از یك محیط پایه مانند تریپتون كه منشاء پروتئینی دارد، كلرید سدیم آگار و 5 درصد خون تشكیل شده است . برخی باكتریها آنزیم های خارج سلولی تولیدكرده كه بر روی گلبول‌های قرمز عمل كرده و آنها راكاملاً لیز می‌كند (همولیزبتا ) یا یك تغییر سبز رنگ در اطراف كلنی ایجاد می‌كند ( همولیز ناقص یا آلفا ) در صورتی كه برخی از باكتریها تغییری ایجاد نمی‌كنند ( همولیزگاما) تولید همولیزین بوسیله باكتری به بسیاری از فاكتورهای محیطی مانند PH ، اكسیژن و دما بستگی دارد. میكروب شناسان اغلب از مورفولوژی كلنی و تولید همولیزین به عنوان آزمایشات غربالگری اولیه جهت كمك به تصمیم در انتخاب مراحل دیگر جهت شناسایی یك باكتری استفاده می‌كنند. جهت مطالعه درست واكنش همولیتیك بر روی آگار خوندار، كارشناس بایستی پلیت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نماید. اگر از لوپ جهت كشت خطی بر روی آگار خوندار استفاده می‌شود باید آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانیسم بتواند در زیر سطح محیط كه اكسیژن كمتری دارد رشدكند . تولید همولیزین های حساس به اكسیژن در برخی از ارگانیسم ها بدین وسیله تشدید می‌گردد . به روش دیگر، می‌توان پلیت‌ها را جهت مشاهده واكنش همولیزین حساس به اكسیژن به طریق بی هوازی نیز انكوبه نمود

 

 

طرز تهیه انواع محیط های كشت

 

:

 

1- ابتدا مقداری آب مقطر در داخل یك ارلن ریخته پودر نوترینت آگار را به آن اضافه و حل نمائید .

 

2- محتویات ارلن را با آب مقطر به حجم برسانید .

 

3- محتویات ارلن را روی شعله حرارت دهید تا بجوشد و محیط شفاف شود .

 

4- محیط كشت را توسط اتوكلاو 15 دقیقه درحرارت c 1210 استریل كنید .

 

5- پس از استریل كردن، بگذارید تا حرارت محیط كشت به 0c50- 45 برسد آنگاه در شرایط استریل ودر مجاورت شعله ، با توجه به حجم محیط ساخته شده، 10ـ 5 درصد خون گوسفند به آن اضافه نموده و خوب بهم بزنید تا كاملاً مخلوط شود .

 

6- محیط را در مجاورت شعله داخل پتری دیش های استریل بریزید .

 

7- پس از پخش محیط در داخل پلیت ها چنانچه در سطح آنها حبابهای هوا تشكیل شود، بااستفاده از شعله حبابها را از بین ببرید .

 

8- ضخامت لایه آگار داخل پلیت ها نباید از 4-3 میلی متر تجاوز كند .

 

9- پس از آماده و منجمد شدن محیط های ساخته شده، پلیت ها را به مدت 24 ساعت در حرارت c370 انكوبه كنید . رشد باكتری بر روی این محیطهای كنترل ، نمایانگر آلوده بودن محیط ها است . بنابراین از این محیطهای آلوده نباید استفاده كرد .

 

محیط بلاد آگار در داخل یخچال به مدت یك هفته پایدار است و چنانچه بنحوی از

برای مشاهده این محتوا لطفاً ثبت نام کنید یا وارد شوید.

• ورود
• یا
• ثبت نام

آب آن جلوگیری شود، پایداری آن بیشتر می‌شود .

 

 

محیط شكلات آگار(Chocolate agar):

 

 

در ساختن این محیط از محیط آگار استفاده می شود . پس از آماده نمودن و استریل كردن محیط پایه ، خون را هنگامی كه هنوز داغ است ( در حدود 0c85 ) به آن اضافه می كنیم .گلبولهای قرمز در این حالت لیز شده و محیط رنگ شكلاتی ـ قهوه ای به خود می‌گیرد . اكنون هموگلوبین و سایر مواد مغذی موجود در گلبولهای قرمز درمحیط وجود دارند . همین ( Hemin ) كه فاكتور x خوانده می شود و كوآنزیم نیكوتین آدنین دی نوكلئوتید (NAD) كه فاكتور V خوانده می‌شود ، به عنوان مكمل به محیط پایه آگار غنی از مواد مغذی اضافه می‌گردند . نایسریا گونوروه و گونه‌های هموفیلوس در میان سایر ارگانیسم های سخت رشد، رشد بهتری درحضور مواد مغذی مكمل اضافه شده به شكلات آگار دارند .

 

 

محیط ائوزین متیلن بلو (E.M.B) :

 

 

یك محیط افتراقی در بردارنده لاكتوز با پپتون وائوزین متیلن بلو است . رنگهای انیلینی موجود در محیط ( ائوزین ، متیلن بلو ) مانع از رشد باكتریهای گرم ـ مثبت می شوند .

 

این رنگها همچنین در PH اسیدی باهم تركیب شده وایجاد رسوب می نمایند . بنابراین می توان از وجود آنها بعنوان شاخصی جهت تخمیر لاكتوز و تولید اسید نیز استفاده نمود .

 

باكتریها گرم ـ منفی بر اساس تخمیر یا عدم تخمیر قند لاكتوز كلنی های صورتی و یا بی رنگ تشكیل می دهند .

 

باكتری اشرشیا كلی ( E.coli ) كه لاكتوز را بشدت تخمیر نموده و مقدار زیادی اسید تولید می نماید، بر روی این محیط دارای جلای فلزی سبزرنگ می باشد .

 

كلبسیلا، انتروباكتر، سراشیا كه تخمیركنندگان ضعیف لاكتوز هستند بر روی محیط كلنی های ارغوانی تولید می نمایند .

 

پروتئوس، سالمونلا، شیگلا كه قادر به تخمیر لاكتوز نیستند بر روی این محیط كلنی های شفاف ایجاد می‌كنند .

 

 

محیط مك كانكی (Mac conkey agar) :

 

مك كانكی آگار معمولترین محیط كشت انتخابی ـ افتراقی بوده ودارای رنگ كریستال ـ ویوله جهت ممانعت از رشد باكتریهای گرم ـ مثبت و اندیكاتور قرمز خنثی (Nautral red) جهت نشان دادن خصوصیات افتراقی می باشد . با سیل های گرم ـ منفی به‌آسانی بر روی این محیط رشدنموده و باكتریهای تخمیر كننده لاكتوز ، محصولات اسیدی تولید نموده كه سبب كاهش PH در محیط اطراف كلنی می گردد . اندیكاتور قرمز خنثی در PH اسیدی قرمز رنگ می‌شود . پس میكروارگانسیم های لاكتوز ـ منفی بی رنگ و شفاف مشاهده می شوند . مك كانكی آگار محیط انتخابی و افتراقی مورد استفاده جهت گونه‌های شیگلا می باشد .

 

طرز تهیه محیط E.M.B و M.C مثل تهیه محیط نوترینت آگار می‌باشد .

 

 

 

محیط سالمونلا ـ شیگلا (s.s) :

 

در محیط S.s تركیباتی مانند پپتون ، لاكتوز ، املاح صفراوی ، نوترال رد، آگار، بریلین گرین ، تیو سولفات سدیم وجود دارد . این محیط فقط اجازه رشد به باكتری های سالمونلا و شیگلا را می دهد . بریلین گرین موجود در محیط مانع رشد باكتریهای گرم ـ مثبت و دیگر گرم منفی ها در محیط S.s می شود . با استفاده از این محیط می‌توان سوشهای تخمیر كننده لاكتوز را از سوشهایی كه توانایی تخمیر لاكتوز را ندارند، تشخیص داد .

 

سالمونلا ، شیگلا قادر به تخمیر لاكتوز نبوده، درمحیط S.s كلنی های بی رنگ ایجاد می كنند كه ارزش تشخیصی دارد .

 

طرز تهیه :

 

برای ساخت این محیط مقدار مورد نیاز پودر S.s را در آب مقطر ریخته و به حجم می رسانید آنگاه بوسیله جوشاندن پودر را در آب مقطر كاملاً حل می‌كنید . این محیط احتیاج به اتوكلاو ندارد .

 

 

 

محیط مانیتول سالت آگار (Mannitol salt agar)

 

یك محیط انتخابی به منظور جداسازی استافیلوكوكهای بیماریزا ( كوآگولازمثبت) از نمونه هایی كه حاوی باكتریهای متعدد هستند بكار می رود

 

غلظت زیاد نمك 5/7% موجود در این محیط مانع از رشد كوكسیهای غیر بیماریزا می شود . پس از كشت باید محیط را در 0C37 بمدت 36 ساعت انكوبه كرد . تخمیر قند مانیتول توسط باكتری مورد آزمایش ، بوسیله معرف فنل ـ رد موجود در محیط مشخص می‌گردد . پس از انقضای مدت انكوباسیون ، استافیلوكوك های غیر بیماریزا بر روی این محیط ، كلنی های كوچك و سفید تشكیل می دهند كه با هاله ای ارغوانی یا قرمز احاطه می شوند . در حالیكه كلنی استافیلوكوكهای بیماریزا زرد رنگ بوده و هاله زرد رنگی نیز آنها را احاطه می كند .

 

طرز تهیه :

 

1- محیط را پس از حل كردن در آب مقطر به كمك حرارت مرطوب به مدت 15 دقیقه توسط اتوكلاو استریل نمایید .

 

2- پس از آنكه دمای محیط به 0c50-45 رسید ، آنرا در پلیت های استریل تقسیم نمائید .

 

 

محیط سلنیت F و تتراتیونات (Selenit f and Tetrathhionate media)

 

این محیط غنی برای رشد سالمونلا بكار می رود و به باكتریهای كلی فرم اجازه رشد داده نمی‌شود . مقدار زیادی از نمونه مدفوع را به 9 تا 10 میلی لیتر این محیط می‌افزایند كه به صورت مایع است . پس از 24 ساعت انكوباسیون برای كشت دوباره محیطی مانند M.C و یا S.S آگار را بكار می برند .

 

 

 

محیط مولر هینتون (Muller-hinton.agar ) :

 

این محیط جهت انجام تست آنتی بیوگرام بكار می رود. این محیط همچنین قادر به فراهم آوردن شرایط رشد خانواده نایسریا نیز می باشد كه در حالت اخیر ، باید محیط را پس از كشت نمونه مشكوك به نایسریا در فشار 10- 5 درصد CO2 انكوبه نمود .

 

طرز تهیه

 

1- مقدار مورد نیاز پودر مولر هینتون را دریك ارلن حاوی آب مقطر ریخته و به حجم مورد نظر برسانید .

 

2- با كمك حرارت ، پودر را در آب مقطر حل كنید تا محیط كاملاً شفاف شود .

 

3- پس از مسدود كردن درب ارلن، محتویات آن را توسط اتوكلاو استریل نمائید .

 

4- پس از آنكه حرارت محیط به 0C 50 ـ 40 رسید محیط را در شرایط استریل داخل پلیت ها تقسیم نمائید .

 

 

 

محیط تریپل شوگر آیرون ( TSI) :

 

این محیط بطور گسترده در تشخیص باكتریهای روده‌ای ( اعضای خانواده انتروباكتریاسه ) كاربرد دارد. كه بصورت شیب دار در لوله آزمایش ساخته می شود و سطح بیشتری برای رشد باكتریها فراهم می‌آورد . كشت در محیط جامد بصورت عمقی ‌ـ‌ سطحی می‌گیرد .

 

محیط TSI حاوی معرف فنل ـ رد ، سولفات فرو ، تیو سولفات سدیم ( برای تشخیص تولید گاز سولفید هیدروژن ) و سه قند گلوگز ، لاكتوز و سوكروز است كه غلظت گلوكز درمحیط 1/0 غلظت دو قند دیگر می باشد .

 

دامنه PH محیط از 8/6 تا 4/8 متغیر می باشد . این محیط قبل از كشت به دلیل داشتن معرف فنل ـ رد قرمز رنگ است .

 

با استفاده از TSI می توان سه خصوصیت را در یك باكتری مشخص نمود.

 

الف : توانایی تولید گاز CO2 , H2 از متابولیسم قندها .

 

ب : توانایی تولید مقادیر زیادی گاز سولفید هیدروژن كه از طریق سیاه شدن محیط مشخص می شود .

 

( بی رنگ ) H2S تیوسولفات سدیم + محیط اسیدی ( باكتری )

 

(رسوب سیاه )FeS یون فریك + H2S

 

ج : توانایی تخمیر گلوكز ، لاكتوز و سوكروز .

 

باسیلهای گرم ـ منفی را بر اساس واكنش ایجاد شده بر روی این محیط می‌توان به پنج گروه تقسیم كرد :

 

در گروه I تخمیر گلوكز ، لاكتوز ، سوكروز ، منتهی به اسیدی شدن ( زرد شدن ) تمامی محیط و تولید گاز می‌گردد.

 

واكنش های ایجاد شده توسط باكتریهای گروه III,II همانند گروه I‌ است و تفاوت آنها فقط در تولید یا عدم تولید گاز است .

 

هنگامیكه عمق و سطح این محیط توسط باكتریهای گروه IV,III كشت داده می شود ، باكتری كشت داده شده ابتدا بطور هوازی و سپس بطریقه بی هوازی شروع به مصرف گلوكز می‌نماید . زمانی كه هر دو طریقه در حال انجام است

 

( ساعات اولیه انكوباسیون ) PH‌ تمامی نقاط محیط كشت اسیدی و در نتیجه محیط زرد رنگ است اما از آنجایی كه تخمیر هوازی در مقایسه با تخمیر بی هوازی با سرعت بیشتری بوقوع می‌پیوندد، گلوكز موجود در سطح به پایان رسیده و باكتریها شروع به تجزیه پپتون موجود در محیط می‌نمایند .از تجزیه پپتون در شرایط هوازی ، بی هوازی آمونیاك (NH3 ) تولید می‌شود . محصولات این عمل خاصیت قلیایی داشته و در نتیجه رنگ سطح محیط مجدداً قرمز می ‌شود . درهمین حال عمق محیط بدلیل سیر‌آرامتر تخمیر بی هوازی گلوكز، همچنان اسیدی و زرد رنگ باقی می‌ماند .

 

گروه V یا سیلهای گرم ـ منفی غیر تخمیر كننده مانند گونه های سودوموناس، پپتونهای موجود در محیط را تجزیه كرده ودر سطح و عمق محیط را بدون تولید گاز، قرمز رنگ می‌نمایند .

 

 

 

مطالب ذكر شده را می توان بصورت زیر خلاصه نمود :

 

گروه I سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S منفی.

 

گروه II سطح زرد / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت.

 

گروه III سطح قرمز / عمق زرد ، گاز مثبت ، H2S مثبت .

 

گروه IV سطح قرمز / عمق زرد ، گاز منفی ، H2S مثبت.

 

گروه V سطح قرمز / عمق قرمز ، گاز منفی ، H2S منفی

[Mahdi Eng 22,940]

انواع محیط کشت باکتریایی

 

کشت های جامد در لوله را می‏توان به صورتهای زیر تهیه کرد :

1. کشت های عمقی Stab Cultures :

حدود 5 الی 10 میلی لیتر از محیط کشت را در لوله آزمایش ریخته و به طور عمودی می‏گذارند تا محیط بسته شود. سپس میکروارگانیسمها را توسط سوزن کشت(آنس) به طور عمقی در مرکزاین محیط کشت می‏دهند

 

۲.کشت در داخل محیط جامد Shake Cultures:

به لوله‏های آزمایش محتوی محیط کشت جامد پس از ذوب شدن که تا 45 درجه سلسیوس سرد شده است. باکتری مورد نظر را افزوده و لوله را بین دستها تکان می‏دهندتا باکتریها کاملا با محیط کشت مخلوط شوند , سپس لوله آزمایش را به طور عمودی قرار می‏دهند تا محیط بسته شود .

۳. کشت شیب دار Slant Cultures:

حدود 5 میلی لیتر از محیط کشت جامد (ذوب شده) در لوله آزمایش و یا لوله‏های کوچک دیگر ریخته می‏شود و پس از سترون کردن آنها را به صورت کج به گونه‏ای می‏خوابانند که سطح محیط کشت شیب دار باشد .

میکروارگانیسمها را با سوزن کشت(آنس) در عمق و سطح و یا به وسیله فیلدوپلاتین نوک حلقه‏ای ( لوپ ) در سطح شیب دار کشت می‏دهند.

کشت جامد در پلیت به سه صورت انجام می‏گیرد :

۱.کشت خطی در سطح محیط های جامد در ظرف پتری:

با این روش می‏توان میکروارگانیسم را بطور خطی توسط فیلدوپلاتین نوک حلقه‏ای (لوپ) در سطح محیط جامد کشت داد.

۲. کشت در سطح محیط :

در این روش توسط پی پت مقداری از رقت معینی از میکروارگانیسم را در سطح محیط جامد ریخته و با میله پخش کننده , کاملا در سطح محیط می‏گسترانند .

۳. کشت های دو لایه :

در این روش کشت مایع باکتری (سوسپانسیون باکتری) به محیط کشت ذوب شده (حرارت 45 درجه سلسیوس ) افزوده می‏شود. در صورت لزوم باکتری را با لایه نازکی از همان محیط کشت می‏پوشانند و پس از بسته شدن محیط ظرفهای پتری را به طور واژگون در گرمخانه قرار می‏دهند تا از ریختن قطرات آب درسطح محیط جلوگیری گردد .

[Mahdi Eng 22,940]

روش آماده‌سازی محیط کشت مایع

 

اولین گام، وزن‌کردن مقدار لازم از پودر محیط‌کشت می‌باشد. این مقدار به دو فاکتور بستگی دارد: حجم نهایی محیط‌کشت موردنیاز و درصد استاندارد محیط‌کشت. باید بدانید که هر محیط کشت درصد استانداردی دارد که توسط شرکت تولیدکننده روی قوطی محصول درج شده است. بنابراین با درنظرگرفتن این درصد و دانستن حجم نهایی مورد نیاز، شما می‌توانید تصمیم بگیرید که چه مقدار پودر لازم دارید. بنابراین: یک کاغذ با کناره‌های صاف روی ترازو بگذارید و ترازو را صفر کنید. سپس مقدار لازم از پودر محیط‌کشت روی آن بریزید تا به وزن لازم شما برسد. دقت کنید که سطح کاغذ شما زیاد ناصاف نباشد تا ذرات پودر در آن گیر نکند. اگر ترازو قابل‌صفرکردن نیست، فراموش نکنید که وزن کاغذ را از وزن کل کم کنید تا وزن پودر را به دست بیاورید.

 

مثال: برای تهیه‌ی 100 میلی‌لیتر محیط‌کشت نوترین مایع، 2 گرم از پودر آماده‌ی محیط کشت را وزن کنید. پودر روی کاغذ را با دقت در یک ارلن بریزید و به آن آب مقطر اضافه کنید تا حجم کل به 100 میلی‌لیتر برسد.

 

مخلوط را خوب به هم بزنید تا پودر کاملاً در آب حل شود. بیش‌تر باکتری‌ها در pH بین 7-7/4 به‌ترین رشد را دارند. پس با کاغذ سنجش pH یا دست‌گاه pH-سنج، مقدار pH را اندازه بگیرید. با اسیدکلریدریک (برای کاهش pH) یا سود قلیایی (برای افزایش pH) تنظیم کنید که pH محیط‌کشت‌تان بین 7-7/4 باشد.

 

برای مشاهده این محتوا لطفاً ثبت نام کنید یا وارد شوید.

• ورود
• یا
• ثبت نام

 

محیط‌کشت مایع را بسته به حجم موردنیاز در لوله‌ی آزمایش (حجم کم‌تر از 10 میلی‌لیتر) و یا ارلن (حجم بالای 10 میلی‌لیتر) آماده می‌کنند. اگر چند لوله‌ی حاوی 5 میلی‌لیتر محیط‌کشت لازم دارید می‌توانید بسته به تعداد لوله‌های موردنیازتان مقدار بیش‌تری محیط‌کشت آماده کنید و بعد از تنظیم pH، آن را درون لوله‌ها به مقدار 5 میلی‌لیتری یا 10 میلی‌لیتری تقسیم کنید. سپس درِ لوله‌ها را با پنبه و فویل آلومینیومی بپوشانید و سپس آن را در اتوکلاو استریل کنید. در صورت نبودن اتوکلاو می‌توانید از جوشاندن برای از بین بردن آلودگی‌های میکروبی استفاده کنید اما در این حالت از درجه‌ی اطمینان کاسته می‌شود، زیرا میکروب‌های مقاوم و اسپورها در دمای 100 درجه‌ی سانتی‌گراد از بین نمی‌روند. پس از سردشدن محیط‌ها می‌توانید از آن‌ها برای کشت‌دادن استفاده کنید.

[Mahdi Eng 22,940]

روش آماده‌سازی محیط کشت جامد

 

پودر محیط‌کشت را به مقدار لازم وزن کنید و در حجم کل آب در نظر گرفته شده حل نمایید و pH آن را تنظیم کنید. روش محاسبه‌ی مقدار پودر در مورد محیط‌کشت مایع و جامد یک‌سان است. در مواردی که کاربرد محیط‌کشت، مشاهده‌ی حرکت باکتری خواهد بود، از درصد کم‌تری پودر آگار استفاده می‌شود.

 

محیط‌کشت‌های جامد دارای آگار هستند که به آن‌ها ویژگی ژله ‌ای می‌دهد. آگار در دمای 94 درجه‌ی سانتی‌گراد حل می‌شود و معمولاً در دمای زیر 40 درجه شروع به بستن می‌کند. بر همین اساس ارلن را روی حرارت غیرمستقیم (شعله‌ی گاز با سه‌پایه و توری یا حمام آب‌گرم) بگذارید و منتظر بمانید تا جوش بیاید. پس از جوشیدن به مدت دو دقیقه و شفاف‌شدن کامل محیط‌کشت، با دستگیره آن را از روی شعله بردارید و کنار شعله قرار دهید تا سرد شود. از پنبه یا گاز استریل برای پوشاندن درِ آن استفاده کنید و ارلن را از شعاع 20 سانتی‌متری شعله خارج نکنید تا محیط‌کشت شما عاری از میکروب بماند.

 

محیط‌کشت باید پس از سردشدن کافی و پیش از بستن آگار، پخش شود. در فاصله‌ی سردشدن محیط، پلیت‌های پلاستیکی یا شیشه‌ای استریل را اطراف شعله‌ی گاز بچینید.

 

 

سپس درِ پلیت‌ها را تک‌تک کنار شعله نیمه‌باز کنید و محتوای ارلن را درون هر پلیت به ارتفاع 0/5 سانتی‌متر بریزید و درِ آن‌ها را بگذارید. در این مرحله وقفه ایجاد نکنید، زیرا محیط‌کشت شما در فاصله‌ی کوتاهی سرد شده و به صورت جامد در می‌آید. دقت کنید که محیط‌کشت کاملاً در کف پلیت پخش شود. روش اشتباه را در شکل زیر مشاهده می‌کنید.

[elahe eli 16]

سلام، چه moیی آنزیم پکتیناز تولید میکنه؟

[Mahdi Eng 22,940]

سلام، چه moیی آنزیم پکتیناز تولید میکنه؟

 

[h=1] توليد آنزيم پكتيناز به روش صنعتي از Mo ها

[/h][h=2]پكتينازها جزء آنزيم هاي خارج سلولي بوده كه توسط هر دو منبع گياهي وميكروبي توليد مي شوند . آنزيمي است كه سوبستره پكتيكي را تجزيه مي كند و نقش مهمي در صنايع غذايي دارد .[/h][h=2]كاربرد پكتيناز در صنايع غذايي

[/h][h=2] 1)صنايع آب ميوه[/h][h=2]2)صنايع روغن كشي[/h][h=2] 3)نرم كردن بافت ميوه وسبزيجات

[/h]

[h=2]منابع ميكروبي :

[/h][h=2]Fusarium - Sclerotonia-Rhizopus-Penicillum-Aspergillus[/h][h=2] solid Fermantation [/h][h=2] توليد صنعتي پكتيناز از طريق تخمير Submerged fermantation

[/h] انتخاب ايزوله هاي قارچي وحشي با توانايي بالا توسط Screenig

[h=2]1-ارزيابي كمي از فعاليتهاي پكتولتيك از 242 نژاد قارچي روي محيط كشت آگار جامد انتخابي[/h] 2-سنجش 13 ايزوله انتخاب شده در يك محيط كشت غوطه وري

3-آزمون 4 ايزوله قارچي انتخاب شده با توجه به ظرفيت آنها براي توليد پكتيناز

فرايند توليد:

[h=2] تلقيح محيط كشت شيب دار با آسپرژيلوس[/h][h=2] انكوباسيون( 37درجه بمدت 3-4روز)

[/h][h=2]جمع اوري اسپورها توسط افزودن 10 ميلي بافر استات به هر slant

[/h][h=2] تلقيح محيط كشت seed culture با اسپورهاي مرحله قبل هم زدن آنها

[/h][h=2]تلقيح محيط كشت تخميري و خيساندن وهم زدن مخلوط به مدت دو ساعت در دماي اتاق

[/h][h=2]جداسازي بيو مسها: تغليظ انزيم به وسيله رسوب توسط امونيوم سولفات

[/h]