گزارش کار آزمایشگاه میکروبیولوژی1 - رنگ آمیزی گرم و متیل بلو

[Mahdi Eng 22940]

رنگ آمیزی گرم و متیل بلو

---

مقدمه:

 

برای شناسایی باکتری ها روش های رنگ آمیزی متفاوتی از قبیل LCBP ، گمیسا ، اسید فاست و گرم وجود دارد.

رنگ ‌آمیزی گرم ( Gram staining) یکی از مهم‌ترین ومتداولترین روش‌های رنگ آمیزی در باکتری‌شناسی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند.

رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. دررنگ آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شود. گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیم از پپتیدوگلیکان است، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.

از رنگ آمیزی گرم در دو جهت استفاده می شود:

۱. شناسایی جنس باکتری

۲. انتخاب آنتی بیوتیک مناسب (باکتری های گرم مثبت در مقایسه با باکتری های گرم منفی نسبت به پنی سیلین G حسّاسیت بیشتری دارند)

با این حال همه باکتری ها را نمی توان با رنگ امیزی گرم مشاهده نمود. فهرستی از باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ امیزی گرم قابل مشاهده نیستند در جدول زیر امده است :

 

[TABLE]

[TR]

[TD=colspan: 4] باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند

[/TD]

[/TR]

[TR]

[TD][/TD]

[TD] نام باکتری[/TD]

[TD] علّت عدم مشاهده باکتری با روش گرم[/TD]

[TD] روش رنگ آمیزی جایگزین[/TD]

[/TR]

[TR]

[TD] 1[/TD]

[TD] مایکوباکتریومها شامل مایکو باکتریوم توبرکلوزیس[/TD]

[TD] وجود مقدار زیادی چربی در دیواره سلولی که از نفوذ رنگ جلوگیری می کند[/TD]

[TD] رنگ امیزی اسید فاست[/TD]

[/TR]

[TR]

[TD] 2[/TD]

[TD] ترپونماپالیدوم[/TD]

[TD] نازکتر از آن است که دیده شود[/TD]

[TD] میکروسکوپ زمینه تاریک یا آنتی بادی فلوئورسنت[/TD]

[/TR]

[TR]

[TD] 3[/TD]

[TD] مایکوپلاسماپنومونیه[/TD]

[TD] نبود دیواره سلولی[/TD]

[TD] روشی وجود ندارد[/TD]

[/TR]

[TR]

[TD] 4[/TD]

[TD] لژیونلّاپنومونیه[/TD]

[TD] عدم دریافت رنگ قرمز[/TD]

[TD] طولانی نمودن مرحله افزودن سافرانین در رنگ امیزی گرم[/TD]

[/TR]

[TR]

[TD] 5[/TD]

[TD] کلامیدیاها از جمله کلامیدیا تراکوماتیس[/TD]

[TD] وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول[/TD]

[TD] ...............[/TD]

[/TR]

[TR]

[TD] 6[/TD]

[TD] ریکتزیاها[/TD]

[TD] وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول[/TD]

[TD] رنگ آمیزی گیمسا یا سایر رنگ آمیزی های بافتی[/TD]

[/TR]

[/TABLE]

 

 

آزمایش :

در این سکشن ، دو نوع رنگ امیزی انجام دادیم ؛ رنگ آمیزی گرم و رنگ آمیزی متیل بلو.

همانطور که در قبل توضیح داده شد ، رنگ آمیزی گرم برای شناسایی نوع باکتری انجام می گیرد. در اینجا رنگ آمیزی متیل بلو هم اریم که فقط برای مشاهده بهتر باکتری ها انجام می شود و در این حالت تمام لایه خارجی ، رنگ می گیرد و می توانیم باکتری ها را مشخص تر ببینیم.

 

ابزار و مواد مورد نیاز برای آزمایش:

آنس حلقوی ، لام ، گیره ، سینی رنگ آمیزی ، پلیت حاوی باکتری ، لوگول ، کریستال ویوله ، سافرانین ، الکل- استون ، متیل آبی

 

شرح آزمایش:

ابتدا برای هر رنگ آمیزی یک گسترش تهیه کنیم. برای تهیه گسترش ابتدا آنس حلقوی را روی شعله می گیریم تا عاری از باکتری شود ، سپس به وسیله همین آنس یک قطره آب روی لام قرار می دهیم. به وسیله آنس حلقوی مقداری از باکتری های کشت شده را از پلیت بر می داریم ( البته این کار باید کنار شعله انجام گیرد) و در قطره آب روی لام حل می کنیم. پس از این کار لام را کنار می گذلریم تا خشک شود.

بعد از این مرحله نوبت به ثابت کردن می رسد. برای این کار کافیست لام ها را روی شعله بگیریم تا کمی لام داغ شود.

تا این مرحله برای هر دو رنگ آمیزی یکسان بود. حال به شرح هر نوع رنگ آمیزی می پردازیم.

رنگ آمیزی گرم : ابتدا لام آماده را روی سینی رنگ آمیزی قرار می دهیم. چند قطره کریستال ویوله روی باکتری ها می ریزیم و به مدت تقریبا یک دقیقه صبر می کنیم ، در طی این مدت همه باکتری ها بنفش رنگ خواهند شد. پس از شستشوی فروتی با آب ، کریستال ویوله را با افزودن لوگول به مدت یک دقیقه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس‌هایی می‌نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می‌شود. پس ازاین مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می‌شوند. پس از این مدت لام را با آب شستشو می دهیم.

حال نوبت به مرحله ی رنگ زدایی می رسد که مهمترین مرحله رنگ آمیزی است. در اینجا ما از الکل – استون برای این کار استفاده کردیم. لام را شیب دار قرار می دهیم و روی آن الکل – استون می ریزیم تا زمانی که آخرین قطره بنفش رنگ از لام خارج شود ( به طور معمول نباید این شستشو بیش از 30 ثانیه به طول انجامد زیرا سبب تغییر رنگ می شود). درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه‌های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه‌ها وغشا می‌گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می‌دهد. ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه ی پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی‌شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند.

در آخر پس از شستشوی لام با آب نوبت اضافه کردن سافرنین می رسد که به مدت 30 ثانیه آن را روی فروتی قرار می دهیم. پس از این کار لام را با آب شستشو می دهیم و پس از خشک شدن با میکروسکوب بررسی می کنیم. برای خشک کردن می توانیم برای سرعت کار از گرمای لامپ استفاده کنیم. دراین مرحله باکتری‌های بی رنگ (باکتری های گرم منفی) به رنگ قرمز درمی‌آیند وباکتری‌های بنفش (باکتری های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی می‌مانند.

 

رنگ آمیزی متیل آبی : لام را روی سینی رنگ آمیزی می گذاریم و متیل آبی را روی فروتی می ریزیم ، پس از یک دقیقه لام را با آب شستشو می دهیم. پس از خشک شدن می توانیم لام را با میکروسکوب مشاهده کنیم.