کشت بافت

[sa-ed 85]

كشت سلول و بافت گياهي كه با عنوانهاي كشت اين ويترو و يا كشت استريل نيزمطرح مي شود، ابزاري مهم در مطالعات پايه و كاربردهاي تجاري است. در حالحاضر به عملياتي نظير كشت سلولها، بافت ها و اندام هاي استريل و اجزايآنها تحت شرايط مطلوب فيزيكي و شيميايي در آزمايشگاه، "كشت بافت گياهي"اطلاق مي شود.

استفاده از فن آوري كشت بافت براي تكثير رويشي گياهان يا ريزازدياديمهمترين كاربرد تجاري اين فناوري است. با اين فن آوري مي توان از يك گياهميليونها گياه جديد، با كيفيت خوب و در زمان كوتاه توليد كرد. كشت بافتسلولي با ارائه تئوري سلولي در قرن 19 آغاز گرديد. اين تئوري عنوان مي كندكه سلول واحد ساختماني مستقل و عملي يك موجود است. كاربرد تجاري كشت بافتدر سال 1960 در آمريكا با ريزازديادي اركيده آغاز شد.

 

 

 

 

 

Click here to view the original image of 1280x960px.

 

 

به طور كلي امتيازهاي روش ريزازديادي را مي توان در موارد زير خلاصه كرد:

1- ياهان تكثير شده به روش كشت بافت از قدرت رشد بالايي نسبت به گياهاني كه به روش هاي سنتي تكثير مي شوند برخوردارند.

2- ازدياد آن گروه از گياهاني كه با روش هاي سنتي به سختي تكثير شده و يا از نظر اقتصادي مقرون به صرفه نيستند.

3- تكثير و توليد تعداد زيادي از كلون هاي با ژنتيك معين.

4- بذور از ريسك كمتري براي جوانه زدن برخوردارند.

5- آزاد شدن از قيود اقليمي موجود از نظر فصل و زيستگاه و در تمام طول سال مي توان گياه توليد كرد.

6- حمل و نقل مواد گياهي را راحت تر مي كند.

7- نگهداري دراز مدت و ميان مواد گياهي.

8- تكنيك هاي كشت بافت در توليد گياهان عاري از ويروس، دستكاري ژنتيكي،هيبريداسيون سوماتيكي، اصلاح نباتات و مطالعات پايه استفاده مي شوند.

 

 

 

 

Click here to view the original image of 1152x864px.

 

 

 

 

 

[sa-ed 85]

[h=2]دستور العمل کاربردی کشت سلول و بافت گیاهی[/h]

مقدمه

وقتی درباره کشت گیاه صحبت می شود معمولاً منظور کشت گیاهان در گلدان، زیرپلاستیک، گلخانه و یا مزرعه می باشد.

تکثیر رویشی که شامل قلمه زدن، خوابانیدن و پیوند زدن می باشد از دیربازدر کشاورزی اهمیت داشته و از آن در تکثیر گیاهان زراعی، درختان میوه و ...استفاده می شود. البته روشهای تکثیر رویشی در شرایط طبیعی در برخی مواردکارآمد نبوده و روش جدیدی از کشت گیاهان، تحت عنوان کشت سلول و بافت گیاهیمعرفی و ارائه شده است.

کشت سلول و بافت گیاهی که با عنوان کشت درون شیشه (invitro ) و یا کشتاستریل نیز مطرح می شود و در مورد تمام انواع کشتهای استریل که در شرایطدرون شیشه ای انجام می گیرد ، به کار می رود.

در حال حاضر تکنیکهای کشت بافت به عنوان ابزاری قوی جهت مطالعه مشکلاتاساسی و کاربردی بیولژی گیاهی در آمده است. علاوه برآن در سالهای اخیر اینتکنیک ها کاربردهای تجاری گسترده ای در تکثیر گیاهان مختلف از جمله گیاهانزینتی و دارویی و نیز حذف عوامل بیماریزا از گیاهان پیدا نموده است.

علاقه مندی به کشت بافت و توانایی آن در اصلاح گیاهان به صورت یک موضوعجهانی درآمده است و افزایش تعداد کشورهای عضو شرکت کننده در موسسه بینالمللی کشت بافت گیاهی گواهی براین ادعا می باشد . علاوه بر آن هیئتبیولوژی گیاهی موسسه تحقیقات سلولی یونسکو (ICRO) ، آموزش تکنیک های کشتبافت گیاهی را به عنوان یکی از برنامه های اولویت دار خود معرفی کرده استو تدریس تکنیکهای کشت بافت جزو برنامه درسی دانشجویان رشته های داروسازی ،پزشکی، کشاورزی، گیاهشناسی، زیست شناسی، جنگلداری و. .... درآمده است.

 

تاریخچه

اولین بار در سال 1838 اشلیدن و شوان تئوری Totipotency را ارائه نمودند.براساس این تئوری ، هر یک از سلولهای یک موجود پرسلولی اگر در شرایط مطلوبمحیطی قرار بگیرند توانائی تکامل و تبدیل شدن به یک موجود کامل را دارند.بعدها این تئوری به عنوان اساس مطالعات در زمینه کشت بافت قرار گرفت.

اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط هابرلنت فیزیولژیست شهیر آلمانی در سال1902 پیشنهاد گردید. وی اظهار داشت طبق مطالعاتی که اینجانب انجام دادهام، مطالعه سیستماتیک سازمان یافته ای روی کشت سلولهای رویشی ایزوله شدهگیاهان عالی انجام نشده است. او بر روی سلولهای ایزوله فتوسنتزی برگ وسلولهای متفاوت دیگر آزمایش کرد که ناموفق بود. با این وجود اظهار داشت کهمی توان به طور موفق جنین های مصنوعی حاصل از سلولهای رویشی را کشت کرد.بنابراین او به طور واضح نظریه توتی پتانسی را بیان نمود و نشان داد کهتکنیک کشت سلولهای ایزوله گیاهی در محلول غذایی، روش آزمایشی جدیدی برایبررسی مسائل مهم است. براساس تحقیقات او در سال 1902 (و بعد از آن) ،هابرلنت به عنوان پدر کشت بافت گیاهی نام گرفت.

پس از آن در سال 1907 اولین کشت سلولهای حیوانی و انسانی انجام شد اما درکشت سلولهای گیاهی پیشرفتی وجود نداشت تا اینکه در سال 1955 هورمون کینتینکشف شد و به دنبال این کشف، کشت سلولها و بافتهای گیاهی رونق گرفت به طوریکه در سال 1958 تعداد آزمایشگاههای کشت بافت گیاهی در آمریکا و کانادا بهبیش از 250 رسید که در هر آزمایشگاه سالانه بیش از یک میلیون گیاه تولیدمی گردد. این رقم در سال 1985 برای هر 18 آزمایشگاه سالانه به 60 میلیونگیاه رسید. پیشرفت مهم دیگری که در سال 1962 صورت گرفت معرفی و تولید محیطکشت MS (موراشیگ و اسکوگ) بود. این محیط یکی از بهترین محیط های کشتی استکه امروزه نیز کاربرد دارد.

برای آشنایی بیشتر در مورد تاریخچه کشت سلول و بافت می توان به موارد ذیل اشاره نمود:

1902: اولین کوشش در کشت بافت گیاهی توسط هابرلنت.

1904: اولین کوشش برای کشت جنین از بعضی گیاهان خانواده شب بو توسط هانیگ.

1922: کشت درون شیشه نوک ریشه توسط رابین.

1934: کشت موفقعیت آمیز ریشه های گوجه فرنگی توسط وایت.

1936 : کشت بافت بازدانگان مختلف توسط دارو.

1939 : کشت موفق ومداوم کالوس توسط گوتره، نوبه کورت و وایت.

1950: باززائی اندامها از بافتهای کالوس درسکویا توسط بال.

1960: تکثیر رویشی ارکیده به وسیله کشت مریستم توسط مورل.

1962: تولید محیط کشت معروف موراشیگ و اسکوگ ( MS ) توسط موراشیگ واسکوگ.

1964: تولید اولین گیاه تا توره ها پلوئید از کشت دانه گروه توسط گِها و شوواری.

1969: اولین جداسازی موفق پروتوپلاست از کشت سوسپانسیون Hapopappus توسط اریکسون و جانسن.

1974: انتقال بیولژیکی در کشت بافت گیاه توسط رین هارد.

1985: آلودگی و انتقال قطعات برگ بوسیله اگروباکتریوم و باززائی گیاهان انتقال یافته توسط هدرج و همکاران.

 

خصوصیات آزمایشگاه کشت سلول و بافت

تعیین محل آزمایشگاه کشت بافت، تصمیم مهمی است. آزمایشگاه نباید در مجاورتآزمایشگاه هایی که از میکروارگانیسم ها و یا حشرات استفاده می کنند یا محلذخیره بذر و مواد گیاهی هستند،تأسیس شود زیرا انتقال آلودگی از طریق دریچههوا و رفت و آمد زیاد،مسئله ساز می گردد.

رفت و آمد زیاد موجب بالارفتن غبار از کف زمین شده و به گسترش آلودگی کمکمی کند. ازقراردادن گلدان حاوی گیاه در فضای آزمایشگاه کشت بافت اجتنابشود چون می توانند منبعی از کنه ها و سایر موجودات آلوده کننده دیگر باشد.بلافاصله بعد از پایان کار در مزرعه یا گلخانه، نباید وارد آزمایشگاه شدزیرا احتمال ورود کنه و حشرات چسبیده به مو یا لباس به داخل آزمایشگاهوجود دارد.

[sa-ed 85]

تجهیزات آزمایشگاهی

تجهیزات و وسایل لازم برای یک آزمایشگاه کشت بافت به شرح زیر است:

- اتوکلاو، از این وسیله برای استیل کردن محیط های کشت و وسایل شیشه ای استفاده می شود

 

- دستگاه لامینار ایرفلو یا هود استریل ، مولد هوای استریل می باشد. هنگام کشت ، گیاه را زیر

.هود استریل کشت دهید

 

- مواد شیمیایی، منظور محیط های کشتی است که برای کشت استفاده می شود. محیط های

کشت عموماً دارای عناصر ماکرو و میکرو، ویتامین، هورمون ، قند و آگار می باشد ( پس از تهیه محیط H p آن بین 7-5

 

- دستگاه آب مقطرگیری

 

- آون (فور)، وسایل فلزی توسط این دستگاه استریل می گردد.

 

- اتاقک رشد یا Growth chamber ، در این اتاقکها از لامپهای آفتابی ومهتابی استفاده شده و دما طوری تنظیم می گردد که تا حدود 25 درجهسانتیگراد باشد (با استفاده از تایمر می توان فتوپرید مناسب را برای هرگیاه را ایجاد نمود).

 

- Hot Plate Magnet ، در تهیه محیط کشت از این دستگاه استفاده شود.

 

- ترازوی حامل، حساسیت آن باید از001/0 باشد تا موادی با مقادیر کم (مانند هورمونها) را نیز بتوان وزن کرد.

 

- شیکر ، در کشت مایع از آن استفاده می شود.

-PH متر

- مواد لازم برای استریل کردن جداکشت، محیط کشت و ابزار کار (شامل هیپوکلریت سدیم و الکل

اتیلیک 70%)

 

- منبع گاز دستگاه لامینار

 

- یخچال و فریزر

[sa-ed 85]

تاقک استریل (دستگاه لامینارایرفلو)

گرچه آماده سازی و قطع قلمه ها، قطعات کالوس و غیره، در یک ظرف شیشه ای ویا در بین ***** کاغذی استریل انجام می شود، ولی انجام این کار در اتاقکاستریل ضرورت دارد. هنگامی که اعمال فوق در یک فضای غیراستریل انجام شودمیزان آلودگی افزایش چشمگیری می یابد، حتی اگر از کاغذ استریل جهت کاراستفاده شود. اتاقک استریل محلی است که هوای مکیده شده از خارج قبل ازورود به آن ، با عبور از *****های بسیار ریز، تصفیه می شود. این سیستمتصفیه جریانی از هوای استریل ایجاد می نماید، همچنین به منظور ضدعفونی خشکاز چراغ الکلی یا چراغ گازی استفاده می شود.

کلیاتی در مورد استریل کردن

استریل کردن شامل استریل مواد گیاهی (جداکشت ها) ، محیط کشت و ابزار موردمصرف در کشت سلول و بافت می باشد. در مورد مواد گیاهی یا جداکشتها، ابتداسطح اندامی که قرار است به عنوان جداکشت استفاده شود (مثل شاخ و برگ یاریشه....) را با مایع ظرفشویی شسته و به خوبی آب کشی کرده سپس جداکشت موردنظر را تهیه و در محلول هیپوکلریت سدیم (وایتکس) قرار می دهیم. باتوجه بهنوع گیاه و نوع جداکشت ، تیماری که برای استریل کردن استفاده می کنیم ،متفاوت است. به این معنی که رقت محلول هیپوکلریت سدیم و زمان قرار دادنجداکشت در آن بسته به نوع گیاه متفاوت است (باید توجه نمود تا نمونه تیرهنشود). لازم به توضیح است که جداکشت یا Explant ( به قطعه ای از گیاه کهدر محیط کشت قرار می گیرد گفته می شود) را می توان از تمام قسمتهای یکگیاه اعم از سیستم انتهای ساقه، برگ، ساقه، ریشه و ... بدست آورد.

از دیگر مواردی که نیاز به استریل کردن دارد، محیط های کشت می باشد. پس ازتهیه محیط کشت دلخواه آن را در شیشه های درب دار (شیشه های سس مایونز شیشههای مناسبی است چرا که هزینه کمی هم دربر دارد) ریخته و در اتوکلاو استریلنمایید.

توجه: درب شیشه های حاوی محیط کشت استریل تنها باید هنگام کار در زیر دستگاه لامینار (اتاقک استریل) باز شود.

استریل کردن ابزار کار نیز از جمله مواردی است که باید رعایت گردد. ابزارفلزی مورد نیاز از جمله دسته تیغ یا قیچی و پنس را داخل فویل آلومینیومپیچیده و در آون با حرارت 200 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت استریل کنید.ظروف پتری را نیز می توان مشابه ابزار فلزی استریل نمود. هورمونها و برخیویتامینها که به دمای بالا حساس هستند را بعد از استریل شدن محیط کشت و درزیر دستگاه لامینار با استفاده از *****های غشایی به محیط کشت اضافهنمائید.

Heat Therapy ، تیمارگرمائی

تیمارگرما برای خلاصی از عوامل آلودگی در گیاه استفاده می شود. یکی ازمهمترین عوامل آلودگی، ویروسها می باشند. گیاهان و ویروسها واکنش یکسانیبه تیمارگرمایی نشان نمی دهند اما باید تعادلی به وجود آید که هم به گیاهاجازه رشد داده شود و هم بیشترین میزان حذف ویروس را داشته باشیم .همانطور که می دانیم در شرایط رشد طبیعی به موازات رشد انتهایی ساقه،ویروس نیز به بافتهای جدید منتقل می شود. اگر گیاه بتواند در درجهحرارتهای بالا رشد کند، در این صورت احتمال کاهش سرعت همانند سازی ویروسوجود دارد و در نتیجه انتهای ساقه می تواند سریع تر از ویروس رشد کرده وعاری از ویروس گردد. سپس می توان انتهای ساقه را که عاری از ویروس است،قطع و آن را کشت نمود. دمایی که معمولا استفاده می شود 36 تا 37 درجه برایچند روز (تا 7 روز) در ماه است. استفاده از برخی مواد شیمیایی در محیط کشتنظیر Ribavirin نیز منجر به تولید گیاه عاری از ویروس می گردد.