شــاروک 30242 اشتراک گذاری ارسال شده در 4 دی، ۱۳۹۱ بهتر است ابتدا آب واكنش درويال ريخته شود. ترجيحاً پس ازافزودن هريك ازمواد واكنش با آب مخلوط گردد. به حداقل رساندن شانس اتصال پرايمر به DNA (ترجيحاً DNA الگو آخرين افزودني قبل از آنزيم باشد) افزودن آنزيم پليمراز به عنوان آخرين ماده واكنش. استفاده از مقادير يكسان از دو پرايمر در واكنش ضروري است ( مگر اينكه Assymctric PCR ) مورد نظر آزمايش باشد. طول معمول پرايمرها 24-18 باز است ولي استفاده از پرايمرهاي با طول 35-30 باز براي واكنش هاي multiplex PCR توصيه مي شود. مطلوب است كه دو پرايمر طراحي شده داراي Tm نزديك هم باشند (حداكثر تفاوت °c5) اگر تفاوت Tm دو پرايمر بيش از °c5 است با افزايش طول پرايمر با Tm پايين تر اين مشكل تا حدي قابل حل است. بهتر است آغاز و انتهاي پرايمر با يك يا دو باز پورين آغاز و خاتمه يابد. مي بايستي توالي پرايمر طراحي شده از نظر تشابه با ساير نقاط ژنومي در برنامه BLAST چك شود. اگر دولكوس بسيار مشابه وجود داشته باشد بهتراست با افزودن 2-1 باز در يكي از دو انتهاي پرايمر به طوري كه باري لكوس بازي مورد نظر اختصاصي گردد طراحي شود. عمومي ترين فرمول جهت محاسبه Tm پرايمر Tm – [(Number of A+T )* 20 C+ (Number of G+C) * 40 ] است كه معمولاً بهترين دماي °c Annealing 5-3 كمتر از Tm پرايمر است. عموماً در واكنش PCR پرايمر ها در رقابت با محصول مطلوب واكنش هستند. در جهت رفع آنها بايد بكوشيم. توالي پرايمر طوري باشد كه موجب ايجاد ساختار ثانويه در آن نشودو توالي به گونه‌اي نباشد كه خود پرايمرها با هم چسبيده و دايمر تشكيل دهند. پرايمرهاي حاوي C,G يا GC در انتهاي ΄3 از كارايي بالاتري در شروع سنتز برخوردارند. در واكنش multiplex PCR, DNAالگو سبب كاهش محصول PCR مي گردد ولي در واكنش هاي ng , Single locus 50-1 داراي نتايج مشابه بوده است.. برای مشاهده این محتوا لطفاً ثبت نام کنید یا وارد شوید. ورود یا ثبت نام لینک به دیدگاه
ارسال های توصیه شده