رفتن به مطلب

تهیه ژل الکتروفورز


ارسال های توصیه شده

تهیه ژل الکتروفورز به صورت گرادیانت

برای بررسی نمونه ای که دارای رنج وسیعی از جرم های مولکولی متفاوت است , باید از ژلی که دارای منافذی با اندازه های متفاوت است (شیب منافذ) , استفاده کرد . در این ژل منافذ در بالای ژل بزرگ تر از منافذ پایین ژل است . در حین پیشرفت کار حرکت پروتئین ها بیشتر محدود می شود . در حضور یک ژل گرادیانت رنج وسیعی از جداسازی حاصل می شود و نسبت به یک ژل با غلظت یکسان , باندها بهتر نگه داشته می شوند .

 

تهیه ژل گرادیانت :

ژلهای گرادیانت اگر چه از ژلهای با غلظت ثابت مشکل تر ریخته می شوند , اما رنج پهناوری از پروتئین ها را جدا سازی می کنند . بعلاوه اینکه محاسبه وزن مولکولی آنها خیلی ساده تر است , زیرا برخلاف ژلهایی که غلظت ثابت دارند , ارتباط بین Log اندازه مولکولها و میزان حرکت آنها در سرتاسر رنج جداسازی روی ژل , خطی است .

 

مواد و تجهیزات :

محلول ژل

ساکاروز (Sucrose)

گرادیانت میکر

پمپ پیریستالتیک با توانایی 1.6ml/min

لوله مخصوص پمپ

بهم زن مغناطیسی

یک دستگاه الکتروفورز , همراه صفحات شیشه ای و اسپیسرها و شانه مخصوص .

جایگاه ریختن ژل

منبع الکتریسیته

 

دستورالعمل :

1- جایگاه ریخته شدن ژل را نصب نمایید .

2- لوله پمپ را به محل اتصال خروجی گرادیانت میکر وصل کنید . سر دیگر آن را به پمپ متصل کنید . طول مدت ریخته گری ژل 5- 10min طول خواهد کشید . لوله دیگر را از پمپ به جایگاه ریخته شدن ژل وصل نمایید .

3- دو نوع محلول با غلظت های کم و زیاد را که در داخل مخزن های گرادیانت میکر ریخته خواهند شد , طبق جدول درست نمایید . این محلول ها دارای آمونیوم پرسولفات است ولی از ریختن TEMED در آنها خود داری نمایید . ژلهای 5-20% و یا 10-20% ژلهای مطلوبی هستند . هواگیری در این پروتوکل لازم نیست . محلول ها را میکس نمایید . محلول غلیظ تر را برای جلوگیری از پلیمریزاسیون در محیط یخ یا آب سرد قرار دهید . محلول غلیظ آکریل آمید ممکن است بدون حضور TEMED و فقط با آمونیوم پرسولفات اضافه شده , پلیمره شود .

4- TEMED را به آرامی به محلول درون مخزنها که در حال میکس شدن است , اضافه کنید . توجه کنید که اول محلول ژل را به گرادیانت میکر اضافه نمایید ( بدون اضافه کردن TEMED ) . فقط قبل از باز کردن شیر خروجی به ازای هر میلی لیتر 33 میکرو لیتر TEMED به محلول اضافه نمایید .

5- محلول غلیظ تر در مخزنی که میکسر دارد و خروجی آن به ژل متصل است , ریخته می شود . در هنگام پر کردن محفظه ژل , محلول غلیظ تر زود تر از همه وارد محفظه ژل می شود . وقتی که محلول غلیظ تر وارد محفظه ژل می شود , به ته آن می رود . محلول رقیق تر به مخزنی که همزن دارد , وارد می شود و بدین ترتیب محلول غلیظ کمی رقیق تر می شود .

6- شیر را باز کنید , تا این عمل انجام شود .سپس ببندید .

7- محلول رقیق وارد مخزن دارای میکسر می شود .

8- محلول در این مخزن میکس می شود .

9- شیر خروجی و پمپ را روشن کنید .

10-وقتی که شلنگ در حدود چند میلی لیتر از محلول غلیظ پر شد , شیر میان دو مخزن را باز کنید . پمپ تا زمانی که محفظه ژل پر شود , روشن باقی می ماند .

11-روی سطح ژل را با 0.3ml آب اشباع شده با n-butanol بپوشانید و صبر کنید تا پلیمریزاسیون انجام شود . سپس ژل بالا (stacking gel)را بریزید .

 

لینک به دیدگاه

آماده سازی ژل IEF

جدیدا به جای استفاده از آمفولایت ها که عدم تکرار پذیری و مشکلات زیادی دارند ، IPG ها بر اساس استفاده از معرفهای ایموبلاین Immobiline تهیه می شوند .ایموبلاینها مشتقات ده گانه ای از کربن آمید هستند که ساختار پایه ای یکسانی دارند (PH=1-12) . بافرهای ایموبلاین دسته مولکولهای شناخته شده ای هستند که هر یک دارای یک گروه بافر کننده اسیدی یا بازی متصل به یک مونومر کربن آمید هستند . از آنجایی که انتهای واکنش دهنده مولکول با ماتریکس آکریل آمید پلیمره می شود ، ایموبلاین های بافر کننده در حین پلیمریزاسیون ایجاد شیب PH می کنند ، که بطور کووالانت از طریق باندهای وینیل به شبکه پلی آکریل آمید متصل می شوند .

روشهایی برای آماده سازی دستی این ژلها وجود دارد ، که البته اکنون از این روشها به ندرت استفاده می شود و بیشتر نوارهای IPG آماده ، مورد مصرف قرار می گیرند . در روشهای دستی ، ژلهای تخت IPG تا محدوده PH مورد نظر بر روی ورقه های شفاف Gel Bound Tagged Films ریخته می شوند که ژل پلی آکریل آمید به خوبی به آنها متصل می شود . ژل ها پس از پلیمریزه شدن ، کاملا با آب دیونیزه شده ، شسته می شوند . یعنی 6 بار و هر بار به مدت 10 دقیقه در آب دیونیزه و بعد در گلیسرول 2% به مدت 30 دقیقه غوطه ور می شوند و سپس در دمای اتاق در نقطه ای که عاری از هر گونه گرد و غباری باشد ، قرار داده می شوند تا خشک گردند و روی آنها با ورقه ای پوشیده می شود . در صورت عدم تمایل به استفاده سریع از آنها ، می توان آنها را برای مدت یک سال در 20- درجه سانتیگراد نگهداری کرد . قبل از استفاده ژلها به میزان لازم برش داده می شوند . همانطور که ذکر شد نوارهای IPG از پیش آماده ، در بازار موجود هستند . این نوارها در طولهای متفاوت بوده و هر چه میزان طول نوارها بلندتر باشد ، تعداد پروتئین هایی که می توانند از هم تفکیک گردند بیشتر خواهد بود . نوارهای 18 یا 24 سانتیمتری معمولا برای جداسازی با قدرت تفکیک بالا استفاده می شوند ، در حالیکه نوارهای 7 یا 11 سانتیمتری برای غربالگری سریع نمونه ها مورد استفاده قرار می گیرند .

مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF

لینک به دیدگاه

روشهای رسوبدهی

در روشهای آماده سازی نمونه ، رسوب دادن پروتئین ها به عنوان یک مرحله اختیاری تلقی می گردد . این روش برای جدا کردن انتخابی پروتئین ها از مواد آلاینده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها ، دترجنت ها ، اسیدهای نوکلئیک ، و غیره به کار گرفته می شود . از این روش برای تغلیظ پروتئین های موجود در یک نمونه که در حالت عادی بسیار رقیق باشند ، نیز استفاده می شود .

باید توجه داشت که هیچ روش رسوب دهی به طور کامل کارامد نیست و برخی از پروتئین ها بعد از رسوب داده شدن ، مجددا محلول نمی شوند . به همین دلیل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی استفاده کردن از این روش را در دستور کار می توان قرار داد . در صورتیکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترین نمایه دو بعدی یک نمونه باشد ، باید از انجام رسوبدهی صرف نظر کرد .

جزء به جزء کردن نمونه(Fractionation)

پروتئین هایی که در بافتهای اوکاریوتی بیان می شوند ، از گوناگونی بسیاری برخوردار بوده ، و دارای محدوده دینامیک (محدوده غلظت پروتئین های داخل یک نمونه بین کمترین تا بیشترین غلظت(Range Dynamic) ) وسیعی هستند . برخی از مواقع در نمونه هایی این چنین ، به منظور کاهش پیچیدگی نمونه و افزایش تعداد پروتئین هایی که دارای نسخه پایین هستند ، نمونه جزء به جزء می شود . می توان از روشهای متفاوتی مانند جزء به جزء کردن اجزاء سلولی (Sub-Cellular Fractionation) ، الکتروفورز در فاز مایع ، کروماتوگرافی جذبی و رسوبدهی انتخابی بهره برد . استخراج پی در پی (Sequential Extraction) پروتئین ها از یک سلول یا بافت بر اساس حلالیت آنها در دسته ای از بافر ها که قدرت و خاصیت محلول سازی آنها به تدریج افزایش پیدا می کند ، روش دیگری از جزء به جزء کردن است .

زمانی که قسمتی از پروتئین های سلول یا بافت مورد نظر باشد ، می توان در حین آماده سازی ، نمونه را نیز جزء به جزء کرد . اگر پروتئین هایی از یک قسمت زیر سلولی خاص مورد نظر باشند ، برای مثال ریبوزوم ها ، می توان ارگانل مورد نظر را توسط سانتریفوژ کردن تمایزی در شیبهای سوکروز جدا نمود . اگر چه این روشها را می توان در سلولهای پستانداران که معمولا دارای جداره سلولی ضعیفی هستند ، نیز به کار برد ، اما دسترسی به اورگانل ها در میکرواورگانیسم های دیگر بسیار مشکل است ، زیرا یک روش لیز کردن برای شکستن کارامد دیواره سلولی مورد نیاز است که در عین حال نباید آنقدر خشن باشد که باعث از بین رفتن ارگانل و تخریب آن شود .

رسوبدهی انتخابی بعضی از کلاسهای پروتئینی توسط استن-TCA صورت می گیرد . دیگر روش ، روشهای عصاره گیری متوالی با بافرهایی که به تدریج قدرت محلول سازی آنها افزایش می یابد ، است . مثلا بافرهای مائی ، حلالهای آلی نظیر اتانول ، کلروفورم و اتانول و محلول های حاوی دترجنتهای مختلف . بالاخره روشهای جداسازی کروماتوگرافی ، الکتروفورز در فاز مائی نیز در جزء به جزء کردن نمونه ها بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی متفاوت پروتئینهای موجود در نمونه قابل انجام هستند . تصمیم در انتخاب هر یک از این روشها بستگی به ماهیت نمونه و هدف از کار با نمونه دارد .

روشهای جزء به جزء کردن ، ممکن است مزایای بسیاری در غنی سازی پروتئین ها داشته باشند ، اما اصلی ترین نکته منفی در استفاده از این روشها ، این است که بسیار زمانگیر و بسیار پیچیده اند . همچنین نمی توان در یک زمان چند نمونه را وارد این مرحله از کار نمود . اما مزیت اصلی آن ،تعیین جایگاه پروتئین ها از نظر ساختمانی در زیر ساختار سلولی و تعیین عملکرد آنها است .

 

 

لینک به دیدگاه

روشهای خارج کردن ترکیبات تداخل کننده

در حین لیز سلولی و بعد از آن ، ترکیبات تداخل کننده ای نظیر آنزیمهای پروتئولایتیک ، نمکها ، لیپیدها ، اسیدهای نوکلوئیک ، پلی ساکاریدها ، و فنل های گیاهی باید غیر فعال شده یا از نمونه تهیه شده خارج گردند .

در این بخش به توضیح این آلاینده ها و اثر آنها بر الکتروفورز 2 بعدی پرداخته و روشهای حذف آنها را شرح خواهیم داد .

پروتئازها

پروتئازهای موجود و حاضر در نمونه باید غیر فعال شوند تا از تخریب پروتئین ها جلو گیری شود . در غیر این صورت پروتئازها با شکستن پروتئین ها سبب پدیدار شدن نقاط مصنوعی در نمایه 2 بعدی می شوند . روشهای مختلفی برای مقابله با پروتئولیز ضمن آماده سازی نمونه وجود دارد . برای مثال استخراج پروتئین در ph بازی ، جوشاندن نمونه در sds و همچنین استفاده از مهار کننده های پروتئازها (pi) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر .

مهار کننده های پروتئاز را می توان به محلول لیز کننده افزود ، اما همیشه این کار توصیه نمی شود . چرا که این مواد ممکن است باعث ایجاد تغییر بار الکتریکی در پروتئین های دیگر شده و سبب ایجاد نقاط مصنوعی شوند . راه حل های دیگر جوشاندن نمونه در بافری با ph بالا نظیر بافر تریس است که دارای sds باشند . برای غیر فعال کردن پروتئاز ها با ph پایین از رسوب دادن با tca 20% بر روی یخ می توان بهره برد .

این نکته را باید در نظر داشت که غیر فعال سازی کامل تمام پروتئازها کاری بسیار سخت است . رسوب دهی توسط tca و استن در کاهش تخریب پروتئین ها و خارج ساختن ترکیبات تداخل کننده معمولا مفید است . اما باید کاملا مراقب بود که پروتئین ها در اثر رسوب دادن ناقص و یا بعد از رسوب دادن ، در حین محلول کردن دوباره ، از دست نروند . نشان داده شده است که محلول های حاوی تیواوره 2 مولار و اوره 7 مولار کارآیی قابل توجهی در مهار کردن پروتئازهای نمونه دارند . تیواوره علاوه بر مفید بودن در حل کردن پروتئین ها به عنوان یک مهار کننده قوی پروتئازها نیز عمل می کند .

اسیدهای نوکلوئیک

حضور اسیدهای نوکلوئیک نیز می تواند در حین ief مسئله ساز شود . این امر ناشی از افزایش در ویسکوزیته نمونه و در بعضی از موارد ایجاد کمپلکس هایی با پروتئین ها ی نمونه است که منجر به مهاجرت غیر عادی و ایجاد رگه های افقی و عمودی در نمایه ژل الکتروفورز 2 بعدی می شود . اگر مشکلاتی از این قبیل بوجود آید بهترین کار متلاشی کردن اسید نوکلوئیک با یک اندونوکلوئاز خالص و مناسب و عاری از پروتئاز است . روش دیگر استفاده از توانایی آمفولیت ها در ایجاد کمپلکس با اسیدهای نوکلوئیک و بعد خارج کردن این کمپلکس ها با اولترا سانتریفوژ است .

نمک ها

نمکها با تغییر در رسانایی و قدرت عبور جریان الکتریکی در ژلهای ipg باعث اختلال در ief شده و تا زمانی که یونهای نمک از انتهای نوارهای ipg خارج نشوند فوکوسینگ پروتئین ها اتفاق نخواهد افتاد . همین امر زمان فوکوسینگ را افزایش می دهد . حضور نمک در نمونه ، ممکن است باعث جابجایی آب موجود در نوار ipg نیز شود . به طوریکه یک سمت ژل خشک و سمت دیگر متورم خواهد شد . از طرف دیگر وجود مقادیر زیاد نمک در نمونه باعث می شود پروتئین ها در نواحی نسبتا عریضی در دو انتهای ژل فوکوس نشوند . به همین دلایل نمک اضافی موجود در نمونه ها باید خارج شوند ، یا به کمترین حد ممکن تقلیل یابند . همانطور که قبلا اشاره شده است باید غلظت نمک موجود در نمونه کمتر از 40 میلی مولار باشد . زمانیکه نمونه در حین خیساندن ژل بار گیری می شود ، باید غلظت نمک کمتر از 10 میلی مولار باشد .

برای نمک زدایی از روشهای مختلفی می توان استفاده کرد ، که رایج ترین آنها استفاده از دیالیز ، تغلیظ کننده های غشائی ، ژل *****اسیون و رسوب دهی است . دیالیز روشی بسیار کارامد است ، که در آن کمترین مقدار از نمونه از دست داده می شود . اما دارای روندی طولانی مدت است و احتیاج به حجم بالایی از محلول دارد . تغلیظ کننده ها ی غشایی یا دیالیز همراه با سانتریفوژ روش سریع تری هستند . اما امکان اتصال پروتئین ها با غشاء دیالیز در این روش بیشتر است . در ژل *****اسیون نیز امکان از دست رفتن پروتئین های نمونه زیاد است .

لینک به دیدگاه

حامل های آمفولیتی

حاملهای آمفولایتی با به حداقل رساندن پدیده توده شدن پروتئین ها از طریق ایجاد برهمکنش های ناشی از بارهای الکتریکی موجود بر روی پروتئین ها باعث افزایش حل پذیری آنها می شوند .

یکی از اساسی ترین چالش های ief تمایل زیاد برخی پروتئین ها به رسوب در نقطه ایزوالکتریکشان است . در برخی از نمونه ها پروتئین هایی وجود دارند که برای حفظ حلالیتشان ، حتی در حضور دترجنت ها ، نیاز به وجود نمک دارند . این امر مشکل ساز است ، زیرا هر گونه نمکی که در محلول وجود داشته باشد ، در حین جریان بالایی که در ابتدای ief اعمال می شود از ژل خارج می شود . بدین ترتیب پروتئین هایی که برای حلالیت خود نیاز به نمک دارند ، با خارج شدن آن رسوب می کنند . از طرفی دیگر ، وجود نمک باعث محدود کردن ولتاژی می گردد که می توان بدون ایجاد جریان بسیار بالا به آن دست یافت ، و این امر سبب افزایش زمان فوکوسینگ خواهد شد . نمک تنها در صورتی باید در یک نمونه حضور داشته باشد که نیاز اساسی به حضور آن باشد و در این صورت تنها غلظت کمتر از 40 میلی مولار قابل قبول است . حامل های آمفولیتی برای جبران از دست رفتن نمک در این نمونه ها عمل می کنند . این حامل ها معمولا در غلظتی کمتر از 0.2% به کار گرفته می شوند ، چرا که در غلظت های زیاد ، تا زمانی که در نقطه ایزوالکتریک خود فوکوس شوند ، سبب کاهش سرعت ief می شوند ، چرا که حامل جریان می باشند و این امر سبب محدود شدن ولتاژ می گردد .

لینک به دیدگاه

به گفتگو بپیوندید

هم اکنون می توانید مطلب خود را ارسال نمایید و بعداً ثبت نام کنید. اگر حساب کاربری دارید، برای ارسال با حساب کاربری خود اکنون وارد شوید .

مهمان
ارسال پاسخ به این موضوع ...

×   شما در حال چسباندن محتوایی با قالب بندی هستید.   حذف قالب بندی

  تنها استفاده از 75 اموجی مجاز می باشد.

×   لینک شما به صورت اتوماتیک جای گذاری شد.   نمایش به صورت لینک

×   محتوای قبلی شما بازگردانی شد.   پاک کردن محتوای ویرایشگر

×   شما مستقیما نمی توانید تصویر خود را قرار دهید. یا آن را اینجا بارگذاری کنید یا از یک URL قرار دهید.

×
×
  • اضافه کردن...