رنگ امیزی گرم

[Matin H-d 18145]

رنگ‌آمیزی گرم (به انگلیسی: Gram staining)

 

یکی از مهم‌ترین ومتداولترین روش‌های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. دررنگ آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شود. گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌است از پپتیدوگلیکان*، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.

 

روش رنگ‌آمیزی گرم

 

پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیّه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند:

نخست رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتری‌ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد.

 

پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول به مدّت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس‌هایی می‌نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می‌شود. پس ازاین مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می‌شوند .

 

مرحله رنگ زدایی:

 

مهم‌ترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می‌گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می‌گیرد. درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه‌های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه‌ها وغشا می‌گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می‌دهد. ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایهٔ پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی‌شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .

در انتها سطح فروتی راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می‌پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار می‌گیرد. دراین مرحله باکتری‌های بی رنگ (باکتری‌های گرم منفی) به رنگ قرمز درمی‌آیند وباکتری‌های بنفش (باکتری‌های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی می‌مانند .

[Matin H-d 18145]

کاربرد رنگ آمیزی گرم

 

از رنگ امیزی گرم به دو جهت استفاده می‌شود:

شناسایی جنس باکتری

آنتخاب آنتی بیوتیک مناسب (باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با باکتری‌های گرم منفی نسبت به پنی سیلین g حسّاسیت بیشتری دارند)

 

با این حال همه یباکتری‌ها را نمی‌توان با رنگ امیزی گرم مشاهده نمود.

[Matin H-d 18145]

فهرستی از باکتری‌های مهم از نظر پزشکی که با رنگ امیزی گرم قابل مشاهده نیستند در جدول زیر امده است.

 

 

[Matin H-d 18145]

رنگ‌آمیزی اسید فاست

 

اسید فاست به باکتری‌هایی گفته می‌شود که در برابر رنگ‌آمیزی رنگ خود را تغییر نمی‌دهند.

 

اکثر دانشمندان بر این عقیده هستند که اسید فاست بودن این ارگانیسم‌ها به خاطر نفوذ پذیری انتخابی دیواره سلول باکتری است. دیواره آنها دارای مقداری موم است و این دیواره سلولی مومی آنها را در برابر اسید الکل مورد استفاده در رنگ آمیزی مقاوم می‌سازد. برای مثال می‌توان mycobactriaها و nocardiaها را نام برد.

 

تجربه نشان می‌دهد اگر دیواره سلولی آنها آسیب ببیند خاصیت اسید فاست بودن خود را از دست می‌دهند.

 

باکتری‌های اسید فاست به باکتریهایی می‌گویند که حتی بعد از بی‌رنگ کردن توسط ترکیب اسید هیدروکلریک در الکل، کربول فوشین (محلول فوشین در مخلوط فنل-الکل-آّب)را نگه می‌دارد. ابتدا اسمیر سلول‌ها را توسط کربول فوشین پوشانده و با حمام بخار حرارت می‌دهند. به‌دنبال آن بیرنگ کردن توسط اسید - الکل انجام شده و سپس رنگ متضاد (سبز یا آبی) اضافه می‌شود. باکتری‌های اسید فاست (مایکوباکتریوم‌ها و برخی از اکتینومایسس‌های وابسته) به صورت قرمز در می‌آیند و بقیه رنگ متضاد را می‌گیرن