ریزازدیادی گیاهان دارویی زینتی

[aiso 15]

ریزازدیادی گیاهان دارویی زینتی

ناصر صباغ نیا1، محمد تقی آل ابراهیم2، مهدی جودی3، سیروس حسن نژاد3، مهدی محب‌الدینی1، محمد مجدی1، پیام پورمحمدی1

1- دانشگاه تربیت مدرس، 2- دانشگاه فردوسی مشهد، 3- دانشگاه تهران

در سالهای اخیر تمایل زیادی برای استفاده از ریزازدیادی در گیاهان مختلف باغبانی بوجود آمده است. روشهای پیشرفته‌ای در اختیار تولیدکنندگان گیاهان زینتی و دارویی قرار دارد که می‌توانند نیاز‌های بازارهای جهانی در قرن آینده را فراهم کنند. این دستورالعمل‌ها براساس سطوح بهینه کربوهیدرات، ترکیبات آلی، مواد معدنی، عوامل محیطی و تنظیم کننده های بوده و مقادیر بالایی از باززایی در شرایط درون شیشه‌ای را پدید می‌آورند. ایران با دارا بودن شرایط متغیر اقلیمی، صاحب تنوع غنی از گیاهان مختلف می باشد. فلور طبیعی گیاهی ایران شامل تعداد زیادی از گونه های گیاهی است اما فرسایش ژنتیکی باعث از دست رفتن گونه های متعددی شده است بطوریکه بسیاری از گونه های با ارزش دارویی و زینتی تحت حفاظت قرار دارند. کشت بافت گیاهی یک روش آلترناتیو برای تکثیر تجاری بوده و برای ازدیاد گونه‌های مختلف دارویی و زینتی مورد استفاده قرار می گیرد. مروری بر باززایی این گیاهان با استفاده از روش های مختلف و ریزنمونه‌های متفاوت ارایه می‌گردد. روشهای کشت سلولی پیشرفته برای تولید چندین متابولیت ثانویه توسعه یافته است زیرا که بیشتر مواد فیتوشیمیایی از متابولیت های ثانویه گیاهان بدست می‌آید. این تحقیق پروتکل های ریز ازدیادی گیاهان مختلف دارویی و زینتی را تشریح می کند. کشت بافت با تولید گیاهان یکسان و یکنواخت و نیز با کیفیت بالا مورد توجه پرورش دهندگان گیاهان دارویی و زینتی است.

کلمات کلیدی: شرایط درون‌شیشه‌ای، گیاهان دارویی، ریز‌ازدیادی، کشت‌بافت

مقدمه:

 

در ساليان اخير تمايل به استفاده از گياهان داروئي و تركيبات حاصل از آنها در حال افزايش است. در حال حاضر بيش از 40% داروهاي مصرف شده در كشورهاي پيشرفته غربي، داراي منشأ گياهي مي‌باشند (Moran et al., 2003) گرايش به استفاده از گياهان داروئي براي توليد دارو در اكثركشورها در حال افزايش است. و كشور ما نيز از اين قاعده مستثني نيست. كشور ما با دارا بودن شرايط مختلف آب و هوايي و برخورداري از منابع عظيم گياهان داروئي مي‌تواند در اين زمينه پيشرو باشد و از پتانسيل‌هاي موجود اين گياهان بهره ببرد. بهره‌برداري غير صحيح و بي‌رويه در گذشته‌هاي نه چندان دور از منابع ژنتيكي علاوه بر اينكه ميزان توليد سنتي را پايين آورده است باعث به خطر افتادن وجود اين منابع گرديده است. اكثر گياهان داروئي با استفاده از روشهاي مرسوم قابل توليد نمي‌باشند و روشهاي ديگري همچون تكثير غير جنسي براي تكثير گياهان زينتي ابداع شده است يك روش كار آمد و مفيد جهت توليد اينگونه گياهان مي‌باشد و امروزه شاهد استفاده وسيع و گسترده از اين روشها در جهت توليد گياهان داروئي مي‌باشيم (Rout et al., 2000) اين روشها علاوه بر تكثير در جهت اصلاح اين گياهان نيز بكار مي‌روند (Shimomura et al., 1997)

اساس كشت:

ضد عفوني و كار در شرايط سترون از ضروريان ريزازديادي مي‌باشد. براي ضد عفوني مواد گياهي جمع‌آوري شده از مزرعه و گلخانه از محلولهاي مختلفي مثل هيپوكلريت‌ كلسيم و هيپوكلريت سديم (‌با غلظت 10-5 درصد) و محلول كلريد مركوريك ( با غلظت 8-01/0 درصد) استفاده مي‌شود. مدت زمان ضدعفوني كردن 25- 10 دقيقه مي‌باشد. يكي از مسايل مورد توجه قهوه‌اي شدن محيط كشت مي‌باشد كه به علت آسايش تركيبات پلي فنوليك مواد گياهي رخ مي‌دهد و تعويض محيط كشت در عرض دو هفته براي رفع اين مشكل مفيد مي‌باشد (Basu and Chanal., 1998) اگر چه تاكنون بيش از 50 فرمول براي محيط كشت ارائه شده است ولي عموما از محيط كشت MS‌ (Murashinge and Skoog., 1962) براي اكثر گونه‌ها استفاده مي‌شود و با اعمال تغييرات لازم وجزئی در اين محيط كشت توانسته‌اند آن را براي نيل به اهداف ريزازديادي سایر گیاهان به کار ببرند. دو گروه مهم شامل اكسين ها و سيتوكنين‌ها نقش اساسي را در مراحل مختلف بر عهده دارند و از تركيبات مختلف اين دو هورمون براي اعمال تغييرات مورد نظر در محيط كشت استفاده مي‌گردد (Bajaj et al., 1998) شرايط انكوباسيون محيط كشت از قبيل نور، دما و رطوبت نسبي از پارامترهاي مهم در كشت محسوب مي‌گردند. اگر‌چه انجام فتوسنتز در اوايل كشت اهميت ندارد ولي در مراحل پاياني كه بايد گياه از حالت هتروتروف به اتوتروف برسد اين پروسه اهميت دارد و در نتيجه كيفيت و شدت نور حايز اهميت است. دما نيز اكثراً براي گونه هاي گرمسيري بايد بيش از گونه‌هاي نواحي معتدله باشد (Thimmappaiah et al., 2002) در مجموع براي نيل به موفقيت بايد كليه شرايط جهت ريزازديادي را بهينه نمود.

ريز ازديادي :

ريز ازديادي براي بسياري از گونه‌هاي گياهي و بويژه گياهان داروئي در طول دو دهه گذشته صورت گرفته است. (Rout et al., 2000) از نظر تئوري و عملي انجام ريز ازديادي ساده است كه با استفاده از جوانه هاي جانبي و انتهايي صورت مي‌گيرد. به علت اينكه عوامل متعددي در ريز ازديادي دخيل مي‌‌باشند نمي‌توان يك پروتكل را براي تمام گونه‌ها توصيه نمود يكي از مهمترين اين عوامل تاثير تنظيم كننده‌هاي رشدي و اثرات متقابل آنها بر گونه‌هاي داروئي است (Mythili and Thomas, 1999) گياهان داروئي مختلف در دست مي‌باشد و وجود سطوح مختلف سيتوكنين براي تكثير اكثر گونه‌هاي داروئي ضروري است ولي بايد با آزمایشات مختلف مقادير بهينه آن را براي گونه‌هاي مختلف تعيين نمود (Suri et al., 1999) ولي مشخص شده است که وجود مقادير كم اكسين در محيط كشت يك مانع عمده در راه تكثير ساقه می‌باشد

(Ramirez Malagon et al., 2003). تعداد ساقه‌هاي توليد شده به ازاي هر نمونه تحت تاثير تركيبات هورمونهاي رشد و نوع ژنوتيپ گونه‌هاي گياهي است (Palai et al., 1997) . در محيط كشت علاوه بر عناصر پر مصرف و كم مصرف، هورمونها مي‌توان به موادي مثل ويتامين‌ها و اسيدهاي آمينه اشاره كرد كه وجود آنها در محيط كشت براي بهبود رشد و نمو لازم است كه در پروتكل‌هاي مختلف به موارد كاربرد هريك از تفضيل پرداخته شده است.

مراحل ريزازديادي براي اولين بار توسط (Murashinge , 1974) توصيف گرديدند. اين مراحل امروزه در همه كارهاي تحقيقاتي و تجاري مبناي كار مي‌باشد. خصوصيت اصلي و بارز اين مراحل اين است كه در تطابق با تغييرات لازم در جهت اعمال براي محيط كشت مي‌باشد. قبل از انجام اين مراحل ، يك مرحله مقدماتي براي آماده‌سازي مواد گياهي و اطمينان از سترون بودن آنها وجود دارد. اولين مرحله پس از آماده‌سازي نمونه ها مرحله استقرار و تثبيت مي‌باشد كه در اين مرحله بايد از قهوه‌اي شدن محيط كشت جلوگيري نمود و در صورت بروز آلودگي در جهت رفع آنها تلاش نمود.

مرحله دوّم تجديد كشت به منظور افزايش تعداد نمونه‌ها و در واقع تحقق هدف اصلي ريزازديادي است. تعداد اين تعويض محيط كشت‌ها نبايد خيلي زياد باشد چون باعث بروز تنوعات ژنتيكي ناخواسته (Somalclonal Variation) مي‌گردد. در گياه Spathiphyllum انجام 6-3 تعويض محيط كشت در هر دوره 7-6 هفته‌اي مناسب می‌باشد (Ramirez- Malagon et al., 2001) مرحله سوم و آخر ريز ازديادي ريشه‌دار كردن گياهان توليدي است كه بيشترین مقدار هزينه‌‌ها را پوشش مي‌دهد و گزارش شده است كه در گياهان مختلف 75-35 درصد هزينه ريزازديادي را به خود اختصاص مي‌دهد (Mereti et al., 2002) . براي ريشه‌زايي بايد ميزان قند محيط كشت زياد شده و از هورمون اكسيني استفاده شود البته در برخي موارد حضور اكسين ضروري نمي‌باشد دماي لازم براي ريشه‌دار شدن اكثر گونه‌ها 28-25 درجه سانيتگراد مي‌باشد (Te chato and Lim, 2000). پس از اتمام كارهاي مرحله بعدي سازگار نمودن گياهان حاصل به شرايط بيروني است براي انتقال به محيط خاكي از خاكهاي مصنوعي مثل پرليت، پاميس و مخلوط ماسه و خاك استفاده مي‌گردد و pH لازم براي اين مخلوط خاك مصنوعي خنثي تا كمي اسیدی مي‌باشد (Kreen et al.,2002) در اين مرحله ميزان رطوبت نسبي به تدريج كاهش مي‌يابد جون گياهان نسبت به كمبود آب حساس مي‌باشند.

براي ريزازديادي گياهان داروئي clavatus Cyrtanthus كه منشأ توليد نوعي آلكالوئيد است از محيط كشت MS به همراه هورمونهاي NAA، BA براي تشكيل ساقه استفاده شد ولي حداكثر تعداد ساقه با استفاده از هورمون 2-4-D بدست آمد (Moran et al,2003) . برگهاي گياه كدوی برگ قلياني داراي خاصيت آنتي باكتريايي و آنتي قارچي مي‌باشند. روش تكثير معمول اين گياهان بصورت استفاده از قلمه ساقه است چون گياهان حاصل از بذر ضعيف بوده و رشد كند دارند ولي استفاده از قلمه ساقه نيز براي تولید انبوه مناسب نيست. استفاده از روش ريزازديادي در توليد انبوه اين گياه باعث شده كه توليد آن داراي صرفه اقتصادي شده و از تفرق صفات نيز جلوگيري شود (Mythili and Thomas, 1999) تحقيقات در زمينه بهبود روشهاي ريزازديادي و ارائه پروتكل‌هاي ريزازديادي براي گياهان داروئي مختلف ادامه دارد. براي بهبود ريز ازديادي گياهان دارویي Cynara Scolymus كه در شرايط درون شيشه‌اي ريشه‌دار نمي‌شد تحقيقي انجام گرفت و مشخص شد كه كاربرد سيكلودكسترين در برطرف كردن مشكل ريشه زايي موثر است (Brutti et al.,2000) يكي ديگر از گياهاني كه توليد انبوه آن با استفاده از ريز ازديادي امكان‌پذير گشته است گیاهی می‌باشد که حاوی يكنوع داروي مقوي است كه بنام Curculigo orchioides شناخته مي شود. ريزازديادي اين گياه با استفاده از نمونه‌هاي برگ و ساقه‌هاي ريز زميني در محيط كشت B5 صورت گرفت و مشخص شد كه mm4/4 از هورمون BAP براي انجام ريزازديادي موثر‌تر است (Suri et al., 1999) براي بدست آوردن پروتكل تكثير گياهان داروئي Salvia hrulcosa از تركيبات مختلف سه محيط كشت NN MS و B5 استفاده گرديد و هورمونهاي TDZ، TBA و BA و كنتين بكار گرفت، نتايج اين تحقيق نشان داد كه محيط كشت MS براي اين هدف مناسب مي‌باشد و غلظت mm7/2 هورمون IBA بهتر نتيجه را در ريشه‌زايي به همراه داشت (Arikat et al.,2003).

توليد متابوليتهاي ثانيويه:

منبع بسياري از مواد استفاده در صنايع داروسازي از گياهان تامين مي‌گردد. كه اين مواد گياهي را بنام متابوليت‌ها ثانيويه مي‌شناسيم. بسياري از مواد داروئي با ارزش جز متابوليت‌هاي ثانونيه گياهان مي‌باشند. در برخي موارد سنتز مصنوعي اين مواد مشكل مي‌باشد و اينكه توليد مصنوعي از لحاظ اقتصادي مقرون به صرفه نيست در اين موارد استفاده از كشت سلولي مي‌تواند يك ابزار قدرتمند براي توليد متابوليتهاي ثانويه محسوب گردد (Ravishankar and Venkataramon, 1998) در يك برنامه موفق توليد متابوليت‌هاي ثانيويه، سلولهاي گياهي بايد بتوانند اين متابوليت‌ها را در مقادير زياد توليد كنند. تجمع متابوليت‌هاي ثانيويه در سلولهاي گياهي بستگي به تركيب محيط كشت، نوع و تركيب هورمونهاي رشد، نمك هاي معدني و منبع كربن دارد. عوامل محيطي نظير دما، نور و تركيب گازي محيط كشت نيز در اين امر دخيل مي‌باشند (Stafford et al., 1985).

از كشت سوسپانسيون ريشه گياه Cephaelis ipecacuanha مي‌توان سفالين و امتين را بدست آورد كه ميزان توليد شده اين در آلكالوئيد در كشت سلولي برابر با مقادير توليدي گياهان مادري در شرايط گلخانه‌اي بود (Teshima et al.,1988) از كشت سوسپانسيون سلولي Cinchona ledgeriana در محيط كشت B5 با lmgllit هورمون NAA مقادير معني‌داري از آلكالوئيد quinolin بدست مي‌آيد (Scrag et al., 1990) حداكثر بيوسنتز Cardenolides در كشت نمونه‌هاي ريشه مويين Digitalis Lan ta حاصل مي‌شود كه ميزان اين بيوسنتز در كشت نمونه‌هاي برگي كمتر است (Pradel et al.,1997) براي توليد بيشتر متابوليت‌هاي azadirachtin و nimbin از گياه داروئي Azadirachta indica مي‌توان از كشت نمونه‌هاي ساقه و ريشه اين گياه استفاده كرد كه در مقايسه با مقادير توليدي اين مواد در گياهان مادري در شرايط مزرعه‌اي بيشتر است (Srividya et al., 1998).

REFERANCES:

Arikat., N. A. Jawad., F. M. Karam., N. S. Rida,A. and Shibli, R. S. (2003). Micropropagation and accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.) Scientia Horticulturae, Azadirachta indica A. Juss. Ind J Plant Physiol 3(2):129–34.

Bajaj, Y. P. S, Furmanowa, M, and Olszowska O. (1998). Biotechnology of the micropropagation of medicinal and aromatic plants. In: Bajaj YPS, editor. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 4. New York: Springer Verlag, pp. 60–103.

Basu P, Chand S. (1998). Tropane alkaloids from callus cultures, differentiated roots and shoots of Hyoscyamus muticus L. Plant Biochem Biotech 7: 39–42.

Brutti, C., Apostolo, N. M., Ferrarotti, B. E. and Krymkiewicz, N. (2000). Micropropagation of Cynara scolymus L. Employing Cyclodextrins to Promote Rhizogenesis. Scientia Horticulturae, 83:1-10.

Kreen., S. Svenssonb, M. and Rumpunenb, K. (2002). Rooting of clematis microshoots and stem cuttings in different substrates. Scientia Horticulturae, 96: 351–357.

Mereti, M. Grigoriadou, K. and Nanos, G. D. (2002). Micropropagation of the Strawberry Tree, Arbutus unedo L. Scientia Horticulturae, 93: 143-148

Moran, G.P. Colque, R. Viladomat, F. Bastida, J. and Codina, C. (2003). Mass propagation of Cyrtanthus clavatus and Cyrtanthus spiralis using liquid medium culture. Scientia Horticulturae 98: 49–60

Murashige T, Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 15: 473–97.

Murashige T. (1974). Plant propagation through tissue cultures. Ann Rev Plant Physiol, 25:135–66.

Mythili, J. B. and Thomas, P. (1999). Micropropagation of Pointed Gourd (Trichosanthes dioica Roxb.). Scientia Horticulturae, 79: 87-90.

Palai SK, Rout GR, Das P. (1997). Micropropagation of ginger (Zingiber officinale Rosc.): interaction of growth regulators and culture conditions. Proc Biotechnology of Spices, Medicinal and Aromatic Plants Kerala, India. pp. 20–4.

Pradel H, Dumkelehmann U, Diettrich B, Luckner M.(1997). Hairy root cultures of Digitalis lanata. Secondary metabolism and plant regeneration. J Plant Physiol 151: 209–15.

Ramirez-Malagon, R., Borodanenco, A., Barrera- Guerra, J. L. and Ochoa-Alejo, N. (2001). Shoot Number and Shoot Size as Affected by Growth Regulators in Invitro Cultures of Spathiphyllum floribundum L. Scientia Horticulturae, 89: 227-236.

Ravishankar GA, Venkataraman LV. (1998). Rapid multiplication of plants from cultured axillary buds of Mentha piperita. Philippine J Sci, 117(2):121–9.

Rout, G.R. Samantaray , S. and Das, P. (2000). In vitro manipulation and propagation of medicinal plants. Biotechnology Advances 18: 91–120

Scragg AH, Ashton S, York A, Bond P, Stepan-Sarkissian G, Grey D. (1990). Growth of Catharanthus roseus suspensions for maximum biomass and alkaloid accumulation. Enzyme Microb Technol 12: 292–8.

Shimomura K, Yoshimatsu K, Jaziri M, Ishimaru K. (1997). Traditional medicinal plant genetic resources and biotechnology applications. Plant Biotechnology and Plant Genetic resources for Sustainability and Productivity.

Biotechnology Intelligence Unit, pp. 209–25.

Srividya N, Sridevi BP, Satyanarayana P.. Azadirachtin and nimbin content in in vitro cultured shoots and roots of Azadirachta indica A. Juss. Ind J Plant Physiol, 3(2): 129–34.

Stafford A, Morris P, Fowler MW. (1986). Plant cell biotechnology: a perspective. Enzyme Microb Techno l 8: 578–87.

Suri, S. S., Jain, S. and Ramavat, G. (1999). Plantlet Regeneration and Bulbil Formation In vitro from Leaf and Stem Explants of Curculigo orchioides, an Endangered Medicinal Plant. Scientia Horticulturae, 79:127-134.

Te-chato, S. and Lim, M. (2000). Improvement of mangosteen micropropagation through meristematic nodular callus formation from in vitro-derived leaf explants. Scientia Horticulturae 86: 291-298.

Thimmappaiah, G. T. and Puthra, S. R. A. (2002). In Vitro Grafting of Cashew (Anacardium occidentale L.). 92: 177-182.