واکنش زنجیره پلی مراز [ pcr ]

[masi eng 47,044]

واکنش های زنجیره ای پلی مراز یا PCR تکنیکی علمی در زیست مولکولی است که انقلابی در دانش و فناوری های زیست مولکولی ایجاد کرد. PCR تکنیکی برای تکثیر یک یا تعداد اندکی از نسخه های یک قطعه DNA به میلیون ها نسخه است. اساس PCR استفاده از توانایی آنزیم DNA پلیمراز برای سنتز رشته های جدید DNA مکمل DNA ای که به عنوان رشته ی الگو در نظر گرفته شده بود، استPCR . در حال حاضر روش معمول و در اغلب موارد ضروری در آزمایشگاه های پژوهش های پزشکی و زیستی است و برای انواع برنامه های کاربردی استفاده می شود، از جمله کلونینگ، تعیین توالی DNA، فیلوژنی یا علم بررسی تکامل موجودات، آنالیز عملکرد ژن ها، تشخیص بیماری های ژنتیکی، تعیین اثر انگشت ) DNAکه در علوم پزشکی قانونی و تست رد اخوت استفاده می شود)، و تشخیص آلودگی ها و عفونت های ویروسی می باشد.

 

 

آنزیم Taq پلی مراز

PCR (Polymerase Chain Reaction) به معنای واکنش زنجیره پلی مراز، روشی برای تکثیر DNA در آزمایشگاه است.تکنیک واکنش زنجیره پلی مراز(PCR) توسط karry Mullisبیوشیمی دان آمریکایی ابداع گردید که امکان تکثیر یک نمونه کوچک از DNA تا میلیون‌ها برابر را در چند ساعت برای محققین فراهم آورد. در سال 1993 ، Mullis جایزه نوبل شیمی را به خاطر ابداعش دریافت کرد.

در PCR از DNA پلی مراز، نوکلیوتیدها و آغازگرها جهت همانندسازی یک توالی ویژهDNA در خارج از سلول استفاده می شود و بدین ترتیب دومولکول DNA به وجود

می آید. سپس به وسیله گرما دادن دو رشته هر مولکول از هم جدا می شود و با همانندسازی مجدد، چهار مولکول دو رشته ای را به دست می آوریم. پس از چرخه بعدی گرم کردن و همانندسازی، 8 مولکول ایجاد می شود و با تکرار آن مولکول‌های DNA به ازای هر چرخه دوبرابر خواهد شد. بعد از فقط 20 چرخه گرمادهی و خنک کردن(که با استفاده از تجهیزات خودکار انجام می شود),این فرایند تصاعدی2 20 یا بیش از یک میلیون نسخه از توالی هدف را حاصل می کند.

چون واکنش زمانی به طور کارآمد انجام می شود که DNA پلی مراز بتواند در حین چرخه‌های گرم کردن پایدار بماند,پژوهشگران از یک DNA پلی مراز مقاوم به حرارت تحت عنوان Taqپلی مراز استفاده می کنند.این آنزیم را از یک باکتری به نام Thermus aquaticus برای اولین بار که در چشمه‌های آب گرم پارک ملی Yellowstone زندگی می کرد به دست آوردند.

 

باکتری Thermus aquaticus

تکنیک PCR کاربردهای نامحدودی دارد. این تکنیک محققین را قادر می سازد تا نمونه‌های کوچک DNA را از منابع مختلف مثلا از صحنه جرم جنایی یا بقایای باستان شناسی تکثیر نموده و مورد ارزیابی قرار دهند.مثلا در سال 1997 محققین اولین آنالیز DNAمیتوکندریایی به دست آمده از استخوان‌های انسان نئواندرتال را گزارش کردند.

یکی از محدودیتهای تکنیک PCR حساسیت بیش از اندازه آن است. حتی مقدار جزیی آلودگیDNA در نمونه, در صورت مکمل بودن با توالی آغازگرها امکان تکثیر داشته و می تواند منجر به نتیجه گیری اشتباه شود.

 

 

مکانیسم PCR

همانطوری كه می دانیم DNA ,یك مولكول مارپیچی دو رشته ای پلی نوكلیوتیدی است كه این دو رشته در جهت مقابل هم قرار گرفته اند و بطور ویژه ای بوسیله پیوندهای هیدروژنی میان بازهای آلی مكمل به یكدیگر متصل هستند.

 

 

سیكل های مختلف PCR

** مرحله واسرشتی اولیه: در این روش ابتدا با استفاده از حرارت دو رشته DNA از هم باز می شوند.

** از این مرحله به بعد وارد برنامه چرخه ای PCR می شویم كه خود شامل سه مرحله است:

مرحله واسرشتی: این مرحله نیز مانند مرحله واسرشتی اولیه,اما با زمانی كوتاهتر از آن انجام می گیرد. دو رشته DNA بطور كامل در این مرحله از هم جدا می شوند. دمای مورد استفاده در این مرحله 95-94 درجه سانتیگراد به مدت 30-20 ثانیه است.

مرحله اتصال: در این مرحله با پایین آوردن دما و رساندن آن به حد مناسب تلاش می شود تا آغازگرها بتوانند با رشته مكمل خود در DNA الگو جفت شوند.

مرحله طویل شدن: این دما باید برای فعالیت آنزیم پلیمراز مناسب باشد و در این مرحله رشته مكمل رشته الگو ساخته خواهد شد و از آنجا كه رشته های ساخته شده جدید نیز مكمل آغازگرها هستند,این چرخه حرارتی می تواند چندین بار تكرار شود و به همین طریق ساخت و تكثیر قطعات ادامه می یابد. دمای این مرحله °c 72 می باشد كه برای فعالیت آنزیم پلیمراز مناسب است.

 

** مرحله طویل شدن نهایی : میكروتیوب ها را در دمای °c 72 به مدت 15- 8 دقیقه,بسته به طول قطعه مورد نظر قرار می دهند. این عمل جهت كامل شدن طول قطعات تكثیر شده انجام می گیرد.