رنگ امیزی دیواره وانجام برخی روش های تشخیصی باکتری های گرم منفی ومثبت

[pary naz 2414]

مواد ووسایل لازم:

کریستال ویوله-آیوداین-الکل استون-سافرانین-اترالکل-

وانکومایسین- کلیستین- محیط کشت Muller Hinton Agar- باکتری -سالین-محلول 0.5مک فارلند

اسید فسفولیبدیک 1%-متیلن گرین-

روش کار:

رنگ امیزی گرم:

نمونه اماده ای که شامل هم باکتری گرم مثبت وهم منفی است وفیکسه شده است را در اختیار داشتیم.

ابتدا کریستال ویوله را روی نمونه ریخته وبعد از یک دقیقه انرا خالی کرده وبا اب مقطر شستشو دادیم.سپس آیوداین را اضافه کرده وبس از یک دقیقه شستشو دادیم.در ادامه الکل-استون را اضافه کردیم وبعد از 5ثانیه شستشو دادیم.

بعد از آن سافرانین را اضافه کرده وبعداز30ثانیه با اب مقطر شستشو دادیم.

سپس با عدسی 10 نمونه را تنظیم کردیم.ودر بین عدسی 40و100یک قطره روغن ایمرسیون را روی نمونه ریختیم ومشاهده کردیم.

آزمون KOH:

ابتدا یک قطره از محلول پتاس ۳% روی یک لام تمیز ریختیم.سپس دو قطره از آن را در دو طرف لام قرار دادیم. با لوب استریل باکتری ای کلای را برداشتیم ودر یکی ازقطره های KOH آنرا حل کردیم ودر قطره دیگر، باکتری باسیلوس سرئوس را حل نمودیم.

تست انتی بیو گرام:

ابتدا باکتری استف اورئوس را با لوپ برداشته ودرسالین حل نمودیم.سپس کدورت انرا با محلول 0.5مک فارلند مقایسه کردیم.باید کدورت هردو تقریبا یکسان باشد.وسوآپ را در محلول وارد کرده و سپس به صورت چمنی روی محیط کشت MHA کشت دادیم و با استفاده ازپنس استریل دیسک کلسیتین را برداشته و رووی محیط کشت قرار دادیم و در طرف دیگر دیسک وانکومایسین قرار دادیم.

رنگ آمیزی دیواره باکتری:

ابتدا یک قطره آب روی لام ریخته سپس باکتری B.subtilisرا با استفاده از لوب استریل برداشته و با آب سوسپانسیون تولید کردیم. صبر کردیم تا خشک شود سپس روی آن اسید فسفومولیبدیک ریخته تا چهار دقیقه صبر کردیم سپس آن را خالی کردیم و بدون شستشو با آب روی آن متیلن گرین ریخته هفت دقیقه صبر کردیم.بعد با آب شستیم و صبر کردیم تا خشک شود سپس لام را زیر میکروسکپ گذاشته و در حالی که عدسی بین بزرگنمایی چهل و صد بود روی لام یک قطره روغن ایمرسیون ریختیم و سپس لام را زیر میکروسکپ مشاهده کردیم.

مشاهده وتفسیر نتایج :

در زیر میکروسکوپ باکتری های گرم منفی به رنگ قرمز وباکتری های گرم مثبت به رنگ بنفش دیده شدند.

علت: تفاوت رنگ دیده شده به علت تفاوت ساختار دیواره سلولی این باکتری هاست. درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایهٔ پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی‌شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .ولی در گرم منفی ها الکل ،چربی های دیواره را درخود حل کرده وباعث خارج کردن کمپلکس کریستال ویوله ازسلول می شود.بنابراین باکتری های گرم مثبت به رنگ بنفش دیده میشود.والکل باعث تنگ شدن خلل وفرج دیواره باکتری های گرم مثبت می شود.بنابراین باکتری های گرم منفی رنگ سافرانین را نشان میدهند.

در ازمون KOH بعد از حل کردن باکتری ای کلای ،با حل کردن حالت کشسان ایجاد شد ولی در مورد باکتری سرئوس این حالت کشسان ایجاد نشد.

علت: باکتری های گرم منفی در اثر تخریب دیواره و بیرون ریختن DNA و سایر مواد داخل سلول یک حالت چسبندگی و کشسانی نشان می دهند ، در صورتی که در مورد باکتری های گرم مثبت اینچنین نیست.

علت:گرم منفی ها به کلسیتین حساس هستند.

گرم مثبت ها به وانکومایسین حساس هستند.

به علت تفاوت ساختار دیواره باکتری های گرم منفی ومثبت تاثیر کلسیتین و وانکومایسین بر انها متفاوت است.

رنگ امیزی دیواره:

سیتوپلاسم سلول های باکتری به رنگ آبی روشن ودیواره به رنگ ابی تیره مشاهده شد.باکتری های گرم مثبت نسبت به گرم منفی ها بهتر رنگ میگیرد زیرا دیواره ساختارضخیم تری دارد.