تعیین مرحله ی رسیدگی جنسی ماهیان خاویاری ماده برای تکثیر مصنوعی: شاخص قطبی شدن تخمک یا pi (الهام بیرانوند از خرم آباد)

[الهام بیرانوند 17]

تعیین مرحله ی رسیدگی جنسی ماهیان خاویاری ماده برای تکثیر مصنوعی: شاخص قطبی شدن تخمک یا PI

شاخص قطبی شدن تخمک یا PI نشانه ی خیلی خوب برای تعیین آمادگی ماهی ماده برای تخم ریزی می باشد، اما خود این شاخص نمی تواند مستقیما تعیین کننده ی کیفیت تخمک ها باشد. تخمک های نارس ممکن است وادار به تخمک گذاری (اوولاسیون) شوند اما تا زمانیکه به رسیدگی نهایی نرسند، قادر به لقاح موفقیت آمیز نخواهند بود. توانایی تخمک ها برای انجام رسیدگی نهایی، تحت تاثیر منفی پاسخ های فیزیولوژیکی یا متابولیکی جاندار به شرایط محیطی یا پرورشی نامساعد از قبیل تغییرات ناگهانی دما و دستکاری ناهنجار یا متناوب [مولدین] می باشد. تخمک ها ممکن است فوق رسیده و دچار فساد و دژنره شدن یا باز جذب مواد مغذی زرده (آتریزیا)، شوند. تخمک های فوق رسیده اغلب با لقاح پایین یا درصد بالا بدشکلی (deformities) جنین و لارو و زنده مانی پایین همبستگی دارد.

در طول دوره ی ذخیره ی زرده، تخمک های ماهیان خاویاری در مرحله ی توقف تقسیم سلولی و هسته قرار دارد(یعنی تقسیم میوز متوقف شده است) و حالت نارس دارند. نزدیک به زمان تخمک گذاری (اوولاسیون)، زمانیکه ماهیان ماده آماده ی تخم ریزی می باشند، تخمک ها به یک اندازه ی خاص مختص به گونه ی خود می رسند و آماده از سرگیری تقسیم میوز و ورود به مرحله ی نهایی رسیدگی می باشند. در طول مراحل رسیدگی نهایی تخمک، هسته یا ژرمینال وزیکول (GV) شروع به مهاجرت به سمت کناره تخمک،که در آنجا ژرمینال وزیکول (هسته) شکسته (GVBD) می شود، می کند. رسیدگی نهایی تخمک با رسیدگی سیتوپلاسمیک همراه است .با وقوع شکست غشاء هسته، تخمک ها از فولیکول رها یا اووله می شوند. تخمک های رها شده را اووم (Ovum) می گویند.

فرایند رسیدگی نهایی تخمک تحت کنترل مواد القاء کننده ی رسیدگی یا MIS می باشد. در بسیاری از حیوانات از جمله ماهیان خاویاری، پروژسترون و مواد مشتق شده از آن بیشترین پتانسیل برای القاء رسیدگی نهایی تخمک را دارا می باشند. فرایند رسیدگی نهایی تخمک و شکست غشاء هسته بطور مصنوعی از طریق انکوباسیون تخمک ها در محلول پروژسترون در خارج از بدن ماهی قابل اجراست.

تولیدمثل موفق و زیست پذیری و قابلیت ادامه حیات تخمک ابتداً به اندازه(قطر مشخص تخمک با توجه به نوع گونه )، PI پایین (کمتر از 10/0))، و مرحله ی رسیدگی تخمک (قطبی شدن قابل تمایز زرده، و شکست 100 درصدی غشاء هسته )بستگی دارد.

دستورالعمل

مولدین ماده در ماه آمادگی تخم ریزی نمونه برداری می شوند.

15 .1 میلی لیتر محلول رینگر به هر پتری دیش تمیز اضافه کنید(نیاز است تخمک ها با محلول پوشانده شوند). دو ظرف برای هر ماهی مولد ماده (ظرف گروه شاهد با برچسب Cو ظرفی برای تیمار پروژسترون با برچسب P) فراهم گردد. اگر آزمایش بر روی چندین مولد ماده در یک زمان انجام می گیرد، شماره متمایز کننده ی مولدین را نیز شامل شود.

15 .2 تخمک را به بشر 20 میلی لیتری با استفاده از یک پیپت پلاستیکی یکبار مصرف انتقال دهید. سپس، در حدود 5 میلی لیتر محلول رینگر از پتری دیش به تخمک ها اضافه کرده و به آرامی بشر را تکان دهید و بعد تخمک ها و محیط کشت به داخل ظروف آزمایش ریخته شوند .

3. 15میکرولیتر از محلول ذخیره پروژسترون (با غلظت 1 میلی گرم در میلی لیتر) با یک میکروپیپت به ظروف با برچسب پروژسترون اضافه کنید . به ظروف شاهد مقدار 75 میکرولیتر از اتانول 95 درصد ) برای انحلال پروژسترون) اضافه شود. به آرامی پتری دیش ها را برای مخلوط شدن محلول ها تکان دهید. مراقب باشید چون حتی مقدار خیلی کم پروژسترون سبب وقوع GVBD در گروه شاهد می شود. ظروف شاهد را روی قفسه های انکوباتورهای با دمای کنترل شده که دقت آن C۫ 5/0± است، انتقال دهید، و ظروف حاوی پروژسترون را روی کف قرار دهید.

4. انکوباسیون برای 16 ساعت در دمای 16 درجه سانتی گراد انجام گیرد.این دما باید یک هفته قبل از زمان نمونه گیری تنظیم گردد.

5. بعداز انکوباسیون، با استفاده از پیپت ها به هر بشر محلول ذخیره رینگر را برای رسیدن به حجم کل 15 میلی لیتر اضافه کنید و به آرامی برای 3-5 دقیقه بجوشانید .سنگ جوش به هر بشر اضافه کنید و آنها را با یک ورقه فویل آلومینیومی بپوشانید، چون تخمک ها گاهی در حین عمل جوشیدن از بشر به بیرون پرتاب می شوند.

6. بلافاصله با قرار دادن بشرها روی یخ خرد شده برای 15-30 دقیقه تخمک ها را سرد کنید.

7. تخمک ها را با یک تیغ ریش تراشی برش داده دهید. معمولاً تخمک های مولدین خیلی رسیده نرمند، حتی بعد از سرد شدن، اما بعد از ذخیره سازی در فرمالین بافر 10 درصد (حداقل برای 30 دقیقه یا به مدت یک شب )سفت تر شده و برش آنها آسان تر می گردد.

8. برش هر تخمک در امتداد محور قطب حیوانی- رویشی انجام می گیرد؛ دو نیمه ی برش داده شده را به سمت بالا بگیرید، و وجود یا عدم وجود وزیکول ژرمینال (GVBD) را از طریق تمرکز تابانیدن نور بر روی سطح برش مشاهده نمایید.

9.هرچه میزان پروژسترون و در نتیجه شکستگی غشای هسته بیشتر باشد؛نشاندهنده ی این است که ماهی مولد به زمان رسیدگی جنسی خودنزدیکتر است. این فاصله ی زمانی در شرایطی است که مولدین در دمای 13-15 درجه سانتی گراد نگهداری شوند. در دمای پایین تر، این زمان ممکن است کمی طولانی تر شود و در دمای بالاتر این زمان کاهش می یابد.