نشانگرهای مولکولی

[masi eng 47,044]

ک نشانگر مولکولی می تواند با یکی از تعاریف زیر شناخته شود :

- یک کروموزوم مشخص یا آللی که امکان ردیابی ناحیه بخصوصی از dna را فراهم می کند.

- قطعه مشخصی از dna که جایگاه آن بر روی ژنوم تعیین شده است.

- ژنی که معمولاً با بیان فنوتیپی به آسانی تشخیص داده می شود، که برای شناسایی یک قطعه مشخص، سلول حامل آن، یا پروب برای علامتگذاری هسته، کروموزوم و یا جایگاه به کارمی رود .

در برخی موارد ممکن است نشانگرهای مولکولی از روی ژن طراحی نشده باشند که معمولاً اثر بیولوژیکی نیز نخواهند داشت اما در عوض می توانند در ژنوم به عنوان راهنمایی برای ژن باشند. این نشانگرها توالی های dna قابل شناسایی هستند که موقعیت اختصاصی از ژنوم را می یابند و طبق قوانین توارثت به نسل های بعدی منتقل می شوند و از آنجا که نشانگرها و ژن های مرتبط بر یک کروموزوم قرار دارند با هم به توارث می رسند. استفاده از توالی های dna جهت ارزیابی تنوع با وجود اینکه هزینه و زحمت زیادی می طلبد اما بدلیل دقت این روش بسیار رایج می باشد، به طوری که روش های بسیاری در چند سال اخیر با استفاده از توالی های dna مطرح شده اند. ایده استفاده از نشانگرهای مولکولی خیلی بیش از این توسط ساکس در سال 1932 و وکسلسن در سال 1933 مطرح شد ولی توسعه تحقیقات آیزوزایم ها و نشانگرهای مولکولی تحول عظیمی در علوم زیستی بوجود آورد به طوری که استفاده از این نشانگرها به طور معمول رایج شد. بدلیل وجود تکنیک های مختلف مولکولی و تفاوت آنها در اصول و دقت مورد نیاز در روش کار یکی از انواع نشانگرها برای انجام کار تحقیقاتی انتخاب می شود

[masi eng 47,044]

کاربردهای نشانگرهای مولکولی

ابداع تکنولوژی نشانگرهای مولکولی نظیر rflp، rapd، aflp و ssr از دوره جدید آنالیزهای ژنتیکی ژنوم های گیاهی می باشد. نقشه ژنتیکی با استفاده از تکنولوژی نشانگرهای مولکولی اهمیت زیادی در مطالعات به نژادی گیاهان، ژنتیک و تکامل گیاهان دارد. نقشه ژنتیکی سراسر ژنوم برای گیاهان زیادی مانند کلم، سویا و ذرت تهیه شده است. عموماً برای تهیه نقشه ژنتیکی در گیاهان مختلف از جایگاه ریزماهواره استفاده می شود.

[masi eng 47,044]

ویژگی های یک نشانگر مناسب

از مهمترین ویژگی های یک نشانگر مناسب دسترسی آسان به آن، سادگی روش کار و سرعت عمل بالا، تکرارپذیری و بالا بودن درصد چندشکلی آن، همبارز بودن و آسان بودن تجزیه و آنالیز داده های حاصل از آن می باشد

[masi eng 47,044]

انواع نشانگرهای مولکولی

یک نشانگر مولکولی مطلوب باید چند ویژگی داشته باشد که مهمترین آنها عبارتند از: چندشکل باشد، به صورت همبارز قابل امتیازدهی باشد تا بتوان افراد هموزیگوت را از هتروزیگوت تفکیک کرد. دارای توزیع تصادفی در ژنوم باشد، آشکار سازی آن آسان، سریع و تکرارپذیر باشد. نشانگرهای مولکولی بر اساس ویژگی هایی نظیر نوع وراثت پذیری، نحوه عمل ژن ( نشانگرهای همبارز یا غالب) و روش آنالیز (نشانگرهای مبتنی بر هیبریداسیون یا مبتنی بر pcr ) در گروه های مختلف قرار می گیرند. به طور کل نشانگرهای dna به دو گروه مبتنی بر دورگ گیری اسیدهای نوکلئیک و تکنیک های مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز تقسیم می شوند.

[masi eng 47,044]

نشانگرهای مبتنی بر pcr

pcr یک تکنیک زیست مولکولی برای تکرار آنزیمی مقدار کم dna بدون استفاده از ارگان های زنده می باشد. این تکنیک در سال 1980 توسط کری مولیس و همکاران ابداع شد و کاربردهای pcr به سرعت افزایش یافت.

هم اکنون طیف وسیعی از نشانگرهای مولکولی بر پایه pcr بوجود آمده اند که بر اساس استفاده از آغازگر تصادفی یا اختصاصی دسته بندی می شوند. از جمله آغازگرهای تصادفی می توان به نشانگرهای daf، rapd و aflp اشاره کرد. آغازگرهای ریزماهواره ( ssr ) در زمره آغازگرهای اختصاصی قرار دارند.

[masi eng 47,044]

اين تکنیک در دهه 1980 توسط كري موليس معرفي شد. به دليل كاربردها و مزيت‌هاي آن به سرعت در زيست‌شناسي مولكولي گسترش یافت به طوری که امروزه در تمامي آزمايشگاه‌هاي زيست مولكولي جزو كارهاي متداول است و بصورت اتوماتيك بوسيله دستگاه ترموسايكلر انجام مي‌شود.

PCR (Polymorphic Information Content) یا واكنش زنجيره اي پليمراز از نظر اصول عملي شباهت زيادي به همانندسازي DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است. اين تکنیک امكان ايجاد رونوشت‌هايي نامحدود از قطعات خاصي از DNA را فراهم مي کند. در این تکنیک با الگو قرار دادن مولکول DNA، اقدام به تکثیر آن قطعه می شود. DNA الگو كه واكنش زنجيره اي پليمراز با آن انجام مي‌شود، مي‌تواند کل DNA ژنومي و يا بخشی از DNA باشد.

PCR تقريباً يك ميليون رونوشت از قطعه‌اي كوچك از DNA الگو ايجاد مي‌كند كه اين مقدار براي استفاده در هر نوع مطالعه ژنتيكي ( بررسی تنوع ،توالی يابي، انتقال ژن، هضم آنزيمي و ...) كافي است. براي انجام PCR، DNA پليمراز، نوكلئوتيدهای تري فسفات و آغازگر لازم است. از آنجايي كه DNA دو رشته‌اي است، همزمان دو نوع آغازگر در PCR مورد نياز است. اين دو آغازگر محل ژني كه بايد تكثير شود را بر هر یک از رشته های DNA مشخص مي‌كند و همچنين اندازه قطعات تكثير را تعيين مي‌كنند.

واکنش شیمیایی آن شامل سه مرحله واسرشت سازی(Denaturing)، اتصال(Annealing) و گسترش(Extension) می باشد. یک نکته مهم در این واکنش اتصال اختصاصی آغازگرها به رشته الگو می باشد که در این امر دمای بسط بسیار حائز اهمیت است.

به این ترتیب که آغازگر قطعه مورد نظر DNA را به همراه DNA پلیمراز، نوکلئوتیدهای تری فسفات و DNA الگو در شرایط کنترل شده قرار داده و با برنامه دمایی معین شرایط تکثیر قطعه مورد نظر مهیا می کنند.

این برنامه دمایی به نحوی است که ابتدا امکان واسرشته سازی DNA فراهم می شود، معمولا واسرشته سازی در دمای 94-93 درجه سانتیگراد انجام می شود مدت در معرض این دما قرار گرفتن رشته DNA معمولا بین 30 تا 60 ثانیه متغییر است، پس از آن دمای مناسب اتصال آغازگر به رشته های DNA اعمال می شود که این دما نیز معمولا بین 65 - 45 درجه سانتیگراد به مدت 45 تا 60 ثانیه متغیر است (این مرحله را اتصال گویند)، و سپس دمای مناسب اتصال مجدد رشته های DNA اعمال می شود که دمای 72 درجه سانتیگراد معمولا به مدت 45 تا 60 ثانیه می باشد(به این مرحله بسط می گویند). این دماها و مدت زمان مناسب آنها به نوع گیاه و آغازگر بستگی دارد. این برنامه دمایی برای 30-40 بار تکرار می شود البته قبل از شروع این چرخه دمایی واسرشته سازی اولیه با همان دمای واسرشته سازی به مدت زمان 3-4 دقیقه و در انتها بسط نهایی با همان دمای بسط (72 درجه) به مدت 5-8 دقیقه انجام میشود.

با اعمال این چرخه های دمایی قطعه DNA مورد نظر به تعداد بسیار زیادی تکثیر خواهد شد.

البته اینی که گفتم کلی دماها و مدت زمان هر مرجله برای هر گیاه و آغازگر بایر اپیتیمایز بشه.

[masi eng 47,044]

اینم شمای کلی از آنچه در مراحل PCR اتفاق می افته

 

مرحله 1) واسرشته سازی

 

 

 

مرحله 2) اتصال

 

 

 

مرحله 3) بسط

[masi eng 47,044]

[h=2]نشانگر rapd[/h]

يكي از نشانگرهاي مبتني بر واكنش زنجيره‌اي پليمراز نشانگرهاي rapd، هستند، با استفاده از اين نشانگرها مي‌توان تفاوت‌هاي چند شكلي dna افراد مختلف در يك گونه و يا گونه‌هاي مختلف را مورد بررسي قرار داد.

استفاده از نشانگرهاي rapd داراي مزايايي از جمله سادگي روش کار، سرعت در ارائه جواب، نياز به مقادير كم dna و عدم نياز به مواد راديواكتيو است

.

در استفاده از نشانگرهاي rapd به اطلاعات قبلي ژنوم‌هاي مورد مطالعه نيازي وجود ندارد در صورتي‌كه در نشانگرهايي كه آغازگرهاي اختصاصي دارند، براي طراحي آغازگرها به اطلاعات اوليه از ژنوم نياز است

.

نشانگرهاي rapd

معمولاً براي سيستم‌هايي كه تعداد زياد نمونه نياز دارند، مانند اصلاح نباتات و اصلاح دام و مطالعات تنوع زيستي مناسب هستند

.

[masi eng 47,044]

[h=2]نشانگر aflp[/h]

در سال 1995 نشانگرهاي جديدي ابداع شدند كه به نظر مي رسد محدوديتهاي نشانگرهاي پيشين را نداشته باشند. تكنيك aflp مبتني بر تكثير انتخابي قطعات برشي حاصل از هضم كل dna ژنومي با آنزيم هاي برشي، توسط pcr مي باشد. پس از هضم dna توسط آنزيم برشي، سازگار سازهاي اليگونوكلئوتيدي به قطعات برشي متصل مي شوند. تكثير انتخابي با استفاده از پرايمرهاي طراحي شده بر مبناي توالي ناحيه تشخيص آنزيم برشي و توالي سازگارساز انجام مي شود به طوريكه در نهايت منجر به تكثير قطعه كوتاهي در حدود 3 باز، از توالي مربوط به خود قطعه برشي مي گردد. با استفاده از اين روش تعداد زيادي از قطعه هاي حاصل از هضم، تكثير و قابل مشاهده مي شوند.

[masi eng 47,044]

[h=2]نشانگرهای EST[/h]

EST ها فقط ژنهاي بيان شده را نشان مي دهند. يك EST توالي ساده از يك همسانه cDNA است كه با يك مولكول mRNA يا بخشي از آن تطابق دارد. ESTهايي با طول 150-400جفت باز براي بررسي تشابه و مكان يابي مفيد هستند. همچنين EST ها را مي توان با توالي هاي موجود در بانك اطلاعاتي ژن ها و پروتئين ها مطابقت داد و به كمك نرم افزارها و برنامه هاي مختلف كامپيوتري ژنهاي مشابه آنها را پيدا كرد.

[masi eng 47,044]

[h=2]نشانگرهای snp[/h]

snp ها چند شكلي مبتني بر تفاوت در يك نوكلئوتيد ( جايگزيني، حذف يا الحاق ) هستند كه در ژنوم فراواني بالايي دارند. اين نشانگرها اطلاعات كمتري نسبت به ساير نشانگرهاي چند آللي نظير ريزماهواره ها دارند. ولي فراواني بالاي آنها در ژنوم، باعث برتري snp ها نسبت به ساير نشانگرها شده است.

[masi eng 47,044]

[h=2]نشانگرهای ریزماهواره[/h]

ريزماهواره‌ها قطعات كوتاهي از dna هستند كه در آنها اشكال خاصي از توالي‌هاي 6-1 جفت باز به صورت تكراري و به دفعات زياد پشت سر هم قرار گرفته‌اند. حداكثر طول اين قطعات تكراري 100-60 جفت باز است. ريزماهواره‌ها تحت عناوين توالي‌هاي كوتاه تكراريstrيا توالي‌هاي ساده تكراري ssrنيز شناخته مي‌شوند

.

اين مكانهاي ژني از تنوع ژني بالايي برخوردار بوده و از 1 تا 27 آلل در هر لوكوس تكثير مي كنند. اختصاصي هستند و همولوژي بالايي بين آنها وجود ندارد. ريزماهواره ها مي توانند به علت ميزان موتاسيون بالا در dna تكراري، نشانگرهاي اختصاصي توليد كنند. ريز ماهواره ها به صورت همبارز به نتاج منتقل مي شوند.

[masi eng 47,044]

نشانگرهای ژنتیکی و کاربرد آنها در اصلاح نباتات:

 

به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود بین ردیف dnaی کرومزوم­های آن­هاست که به نتاج نیز منتقل می­ شود.حتی صفاتی که تحت تأثیر شرایط محیط نیز به صورت متفاوت بروز می­ کنند،­بازتاب تفاوت­های موجود در ردیف­های dna هستند. این تفاوت­ها می­توانند به­ عنوان نشانه (نشانگر) ژنتیک به کار گرفته شوند که ممکن است به طرق مختلفی تظاهر یابند.برخی از این تفاوتها در صفات قابل رؤیتی مانند رنگ گل،وجود یا عدم وجود ریشک در گل­چه غلات یا صاف و چروک بودن سطح دانه­ های نخود فرنگی در آزمایش­های مندل که ناشی از لینکاژ ژنی است تجلی می­ کنند.

برخی از این تفاوت­های موجود در ردیفdna بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین­هایی با اندازه­ های متفاوت تجلی کنند که به روش­ های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت، رؤیت و مطالعه می­ شوند. این قبیل نشانگرها را " نشانگرهای ملکولی در سطح پروتئین"(نشانگرهای بیوشیمیایی) می­ نامند که از آن جمله می­ توان به سیستم"آیزوزایم/آلوزایم"اشاره کرد. دسته ای دیگر از تفاوت­های موجود در سطح dna هیچ تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل می­ کنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه­ ی پروتئین،تأثیری بر جای می­ گذارند. در این دسته از تفاوت­ ها را می­ توان با روش­ های مختلف شناسایی، مشاهده و ردیابی کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد.این نشانگرها که تعدادشان تقریباً نامحدود است، فقط از راه تجزیه و تحلیل مستقیم dna قابل ثیت و بررسی هستند و بنابراین به آنها"نشانگرهای ملکولی در سطحdna" گفته می­ شود.به طور کلی، برای آن­که صفتی به عنوان نشانگر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد،باید دست کم دو ویژگی را داشته باشد:1-در بین دو فرد متفاوت باشد(چند شکلی یا پلی­مورفیسم نشان دهد).2-به توارث برسد. بنابراین صفاتی مانند داشتن یا نداشتن ریشک و رنگ گلومل دانه­ی برنج که ممکن است در بین­ دو والد در یک تلاقی متفاوت باشد و به نتاج نیز منتقل می­شود،" نشانگرهای ژنتیک"تلقی می­شود.در مقابل،تعداد دانه در روی خوشه یا ارتفاع درخت چنار که معمولاً در بین نمونه­های مختلف متفاوت هستند،به دلیل اینکه عیناً به نتاج منتقل نمی ­شوند، نمی­ توانند به عنوان نشانگر ژنتیک منظور شوند.تحولی که در زمینه­ ی علوم زیستی و از جمله کشاورزی به نشانگرهای ملکولی نسبت داده می شوند،به دلایل زیر است:1-فراوانی فوق العاده ­ی این دسته از نشانگرها2-عدم تأثیرپذیری آن­ها از شرایط محیطی خارجی و داخلی موجود3-امکان به کارگیری آن­ها در مراحل نخستین رشد گیاهان4-فراهم نمودن امکان مطالعه­ ی گیاهان در خارج از فصل و محل کشت 5-دقت و قابلیت مطلوب تفسیر نتایج6-هم بارز بودن بسیاری از این نشانگرها7- امکان استفاده از آن­ها در مورد گونه های منقرض شده8-سهولت تشخیص افراد خالص از ناخالص9-سهولت امتیازدهی وتجزیه وتحلیل نتایج10-دسترسی به برنامه­ های رایانه ­ای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج انواع نشانگرهای ژنتیک:شاید قدیمی­ترین ابزاری که در سال­های اخیر جهت بررسی تفصیلی گیاهان عالی به ­وجود آمده­ است،نشانگرهایdna است. به طور کلی نشانگرهای ژنتیکی به انواع زیر تقسیم می­ شوند:1-مورفولوژیک 2-پروتئینی 3-مولکولی(dna و rna)تاکنون تعداد زیادی از نشانگرهایdna معرفی شده ­اند و در تجزیه­ های ژنتیک موجودات مورد استفاده قرار گرفته ­اند.از ویژگی­های خوب آن­ها موارد زیر قابل ذکر است:1-درجه ی بالای چندشکلی(پلی­مورفیسم)2-غالب یا هم­بارز بودن3-تعداد زیاد جایگا­ه­ های تجزیه شده در هر آزمایش4-توزیع کامل در سطح کرومزوم5-داشتن تکرارپذیری6-نیاز یا عدم نیاز به توالی یابیdna الگو7-هزینه.

در اوایل دهه­ ی(1980 .م)"بوتستین" و همکارانشrflp راکشف کردند که پیامد منطقی کشف آنزیم­ های برشی بودکه هنوز هم از قدیمی­ترین و معتبرترین نشانگرهای dna است. کشفpcr نیز باعث ابداع نشانگرهای مبتنی بر pcr شده­است و تعدادشان در حال ازدیاد است. نشانگرهایdna سیر تحول و تکامل را هنوز به تکامل نرسانده ­اند و ابداع و معرفی روش­های متنوع و جدیدتری از آن­ها، همچنان ادامه دارد.