گزارش کار آزمایشگاه میکروبیولوژی1 - رنگ آمیزی اسپور

[Mahdi Eng 22940]

مقدمه :

اسپور :

 

اسپور درباکتری ها یک فرم مقاوم است و فرم زایشی نیست ، و این برخلاف کپک ها و مخمرهای قارچی است . از هرباکتری فقط یک اسپور به وجود می آید و از هر اسپور نیز یک باکتری به وجود می آید.

 

اسپورها فقط در باکتری هایی تولید می شوند که ژن های مخصوص اسپور زایی داشته باشند. اسپور زایی یک وجه تشخیص و افتراق برای باکتری است . در فرایند اسپور زایی 200 ژن دخالت دارند. باکتری ها در زمان احساس خطر اگر ژن اسپورزایی داشته باشند خود را به اسپور تبدیل می کنند.

منظور از عوامل نامساعد محیطی عواملی چون : حرارت ، رطوبت ، تشعشعات مثل نور فرا بنفش و PH است.

درزمان شرایط نامساعد محیطی حدود 200 ژن گفته شده یکی یکی شروع به فعال شدن می کنند و سیتوپلاسم خشک می شود. همزمان با این اتفاق DNA سلول همانند سازی می کند. قسمتی از DNA که همانند سازی شده از قسمت اصلی جدا می شود.

مواد سیتو پلاسمی متراکم شده و در اطراف یکی از کپی های باکتری جمع می شوند. قسمتی از سیتوپلاسم متراکم شده و اطراف آن غشا و دیواره تشکیل می شود که ترکیباتی چون D.P کولینات کلسیم ( سیمان غشا اسپور) در آن وجود دارد. دیواره اسپور به مرور زمان ضخامتش زیاد شده و در قسمتی از سلول جایگزین می شود. در این حالت باکتری به خواب می رود.

میزان سوخت و ساز اسپور کمترین مقدار ممکن است. به اسپوری که به ای حالت تولید شده آندواسپور می گویند و به اسپوری که از باکتری خارج می شود اگزو اسپور می گویند. موقعیت قرار گیری اسپوردر داخل باکتری متفاوت است ، به طوری که:

1- اگر دروسط سلول تشکیل شود central

2- اگر اسپور در یکی از دو انتهای باکتری تشکیل شود terminal

3- اگر اسپور مابین انتها و وسط سلول تشکیل شود sub terminal

اسپور از نظر شکلی به دو شکل گرد و یا بیضوی است. قطر اسپور می تواند از قطر باکتری بزرگتر باشد که آن را Bulbing می گویند( باکتری باد کرده).

باکتری هایی که اکثرا اسپور تولید می کنند مربوط به خانواده با سیلاسه هستند.

1- باسیلوس

2- کلستریدیوم

همگی این خانواده به صورت میله ایند. در کوکسی ها هم برخی اسپور تولید می کنند که به آنها اسپوروسالسینا می گویند.

عمل تبدیل اسپور به فرم فعال را جوانه زدن می گویند ( germination )

 

اجزا اسپور عبارتند از:

1) core ( قسمت مرکزی ) : حاوی سیتوپلاسم متراکم، DNA ، ریبوزوم ، RNA ، آنزیم های که همیشه کاربرد دارند.

2) لایه ای به نام core wall ( دیواره اسپور) : شامل دو قسمت دیواره سلولی و غشاسیتوپلاسمی است.

3) لایه ای به نام cortex.

4) لایه ای به نام spore coat ( پوشش های اسپور): بیشتر از یک لایه است.

5) قسمت بیرونی به نام Exosporium .

 

 

برای رنگ آمیزی اسپورها 3 روش وجود دارد:

 

1- wirty Conklin

 

2- schaeffer – falton

 

3-dorner

 

 

 

مالاشیت گرین :

 

از مالاشیت گرین در صنعت به عنوان دارویی برای مقابله با انگل ها و قارچ های آبی استفاده می شود. این ماده به طور معمول در مراکز تولید مصنوعی ماهی کپور معمولی ( Cyprinus carpio ) به عنوان داروی ضد قارچ استفاده می شود ، اما این دارو به عنوان عامل بروز ناهنجاری ، ماده ای جهش زا ، عامل پیش سرطان ، آلوده کننده ی محیط های آبی شناخته و مصرف آن ممنوع گردید ، اگر چه همچنان در بسیاری از مراکز تکثیر و پرورش آبزیان در ایران از این ماده استفاده می شود. از جمله موادی که می توان به جای مالاشیت گرین استفاده کرد ، پراکسید هیدروژن ( H₂O₂ ) است. آژانس دارو و غذای آمریکا (FDA ) پراکسید هیدروژن را در گروه دارو های کم ضرر ( با اولویت نظارت کم LPR ) رده بندی کرده است.

 

آزمایش:

در اینجا ما برای رنگ آمیزی اسپور ها از روش schaeffer – falton استفاده می کنیم. در رنگ آمیزی wirty Conklin تمامی مراحل مانند رنگ آمیزی schaeffer – falton است با این تفاوت که هنگامی که رنگ مالاشیت گرین را اضافه کردیم حرارت نمی دهیم و در رنگ آمیزی DORNER نیز از نکروزین استفاده می کنیم. بعد از انجام آزمایش خواهیم دید اسپور باکتری ها در کدام قسمت قرار گرفته است ، داخل ( Center , terminal , sub terminal ) یا خارج باکتری.

 

ابزار و مواد مورد نیاز آزمایش:

مالاشیت گرین ، سافرانین ، آنس حلقوی ، لام ، گیره ، سینی رنگ آمیزی ، پلیت حاوی باکتری

 

شرح آزمایش:

در اول باید یک گسترش ( Smear ) تهیه کنیم. آنس حلقوب را با حرارت ضد عفونی می کنیم و با آن یک قطره آب روی لام می گذاریم. از پیپت باکتری ، در کنار شعله با آنس حلقوی ، مقداری باکتری بر می داریم و در قطره آب روی لام پخش می کنیم. پس از خشک شدن آن را روی شعله می گیریم تا ثابت شود.

حال محلول مالاشیت گرین را روی لام میرزیم و به مدت3 تا 5 دقیقه حرارت می دهیم اما این حرارت نباید به طوری باشد که سبب تبخیر مالاشیت گرین شود. پس از این لام را با آب شستشو می دهیم و محلول سافرانین را روی لام میریزیم. پس از گذشت یک دقیقه آن را با آب شستشو می دهیم زیر نور لامپ قرار می دهیم تا خشک شود.

بعد از خشک شدن لام می توانیم آن را با میکروسکوپ بررسی کنیم. مقداری روغن ایمرسون یا سدر به آن اضافه می کنیم و با عدسی 100 می توانیم مشاهده کنیم.

در مشاهده خواهیم دید که اسپورها سبز رنگ ( به رنگ مالاشیت گرین) و سلول های رویشی باکتری قرمز رنگ ( به رنگ سافرانین ) هستند. اسپورها را در دو حالی بیرونی ( External ) و داخلی (( Internal مشاهده می شود.

در مشاهدات ما بیشتر اسپور ها به صورت بیرونی و دارای تراکم زیادی بودند که در تصویر قابل مشاهده است. البته در تصاویر می توان اسپورهای داخلی را نیز مشاهده کرد.