کروماتوگرافي مايع با فشار زياد hplc

[spow 44,195]

«کروماتوگرافي مايع با فشار زياد HPLC »

 

مي دانيم كه كروماتوگرافي روشي است براي شناسائي و جدا سازي و اندازه گيري مواد است. HPLC يعني كروماتوگرافي مايع با فشار زياد يا كروماتوگرافي مايع با كاركرد عالي است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرك تشكيل شده است. كه فاز ثابت ممكن است جامد و يا مايع باشد و فاز متحرك مايع است.

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC

1- مخازن حلال: كه در آنها فاز متحرك و يا حلالهاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.

2- موتور يا پمپ: چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه حلال جريان داشته باشد بايد فشاروجود داشته باشد. براي ايجاد فشار از پمپ يا موتور استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند. و بايد بتواند فشار ثابت ايجاد كند. حلال توسط پمپ با فلوي ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود. حداكثر فلوئي كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو فرق مي كند، هر چه فلو كمتر باشد، فاصله ي پيك ها بيشتر است. چهارمخزن داريم مخزنD, C, B, A ميزان فشار بستگي به فلوي ما دارد وقتي فلو ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 مي شود. ميزان فشار بستگي به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است. حداكثر فلوريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن مي گيرد و با سرعت گذر ثابتي آن را بداخل دستگاه وارد مي كند. در دماي آزمايشگاه كار مي كنيم.

به دو روش مي توانيم كار كنيم:

1- روش ايزوكراتيك isocratic: اگر نسبت هاي مختلفي از فاز متحرك را در يك مخزن بريزيم و از همان مخزن فاز متحرك را برداشت كنيم از روش ايزوكراتيك استفاده كرده ايم. مثلا در کار عملي انجام شده درآزمايشگاه فاز متحرك( 80% بافر فسفات 12% متانل و 8% استونيتريل) است كه پس از صاف كردن همه را در يك مخزن مثل D مي ريزيم و از همان مخزن پمپ برداشت مي كند.

2- روش گراديانت gradient :اجزاء فاز متحرك در مخازن مختلف ريخته مي شود. دستگاه قابليت اين را دارد كه خودش نسبت هاي مختلف را از مخازن برداشت كند (طبق داده هاي ما)، مثلا مي خواهيم ازمخزن A، 80% از مخزن B 8% و از مخزن C 12% بكشد. و بعد نسبت ها را مخلوط مي كند. از اين روش وقتي استفاده مي كنيم كه نسبت هاي موردنظر را نمي دانيم و بخواهيم روش کارپيدا كنيم. ولي وقتي درصد فاز متحرك براي ما روشن شد مي توانيم از روش ايزوكراتيك استفاده كنيم. فاز متحرك با فلوي ثابتي بر روي ستون حركت داده مي شود حداكثر فلو در اين آزمايش ml/min0.8 يا 1 است. بعد از فعال كردن هر پمپ flow rate را از كم به زياد كم كم بالا مي بريم تا حدود ml/min 0.8 يا 1 و مي گذاريم حدود يك ربع ساعت يا نيم ساعت با فلوريت بالا كار كند و بعد فلوريت را به تدريج پايين مي آوريم تا صفر و بعد پمپ را عوض مي كنيم. يا دستگاه را خاموش مي كنيم، فلوريت كه بالا برود فشار هم بالا مي رود. بعد از اتمام كار ستون را با حلالهاي شستشو دهنده مي شوئيم. حلالهاي شستشو را در مخازن ريخته و پمپ ها را به ترتيب فعال مي كنيم اول دستگاه را با آب و متانل شسته و سپس با متانل خالص مي شوئيم. هر پمپ را كه فعال كرديم بايد ابتداهوا گيري کنيم.

تهيه بافرفسفات: 13.6 گرم از Po4H2K را وزن كرده (0.1M) و به حجم يك ليتر مي رسانيم pH ، 4.5 مي شود كه با اسيد فسفريك غليظ حدود يك دو قطره pH را به حدود 3.5 مي رسانيم.

3- injector: از سرنگهاي مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق 30 ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون واكنش ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.

4- ستون: طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانل و بعد با متانل خالص شستشو مي دهيم. فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است. كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود، گارد كالوم را پس از مدتي بايد عوض كرد، ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست. اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و حلال قطبي باشد. سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده مي شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.

5- رديابها: رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد. انواع رد ياب ها: (a )- مهمترين آنها ردياب ماورا بنفش است که براي اجسامي كه در ناحيه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار مي گيرد. در اين دتكتور جذب انجام مي شود و باعث كاسته شدن انرژي مي شود كه اين كاسته شدن قابل اندازه گيري است. ميزان كاسته شدن انرژي متناسب است با غلظت، بايد طول موج را مشخص كنيم كه در اينجاnm ?=225 است. حلال نبايد در طول موج انتخابي جذب داشته باشد..

.bردياب ضريب شكست، اين ردياب خيلي حساس به حرارت است.از تغييرات يا تفاوتي كه بين ضريب شكست سيستم حلال به تنهايي و سيستم حلال همراه نمونه ايجاد مي شود استفاده مي كنيم.

c. دتكتور فلورسانس حساس تر از UV است ولي كم مصرف مي باشد چون موادي كه خاصيت فلورسانس داشته باشند كم هستند.

. dردياب الكتروشيميايي كه عملکرد آن بر مبناي واکنش هاي اکسيد و احيا مي باشد.

6- ثبات (ركوردر): در اثر حركات قلم پيك هائي رسم مي شود كه به مجموعه آنها كروماتوگرام مي گويند.به طريق كيفي پيك ها را براساس زمان باز داري يا نگهداري يا Retention time مي شناسند. زمان بازداري فاصله زماني از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يك پيك است. براي محاسبه كمي سطح هر نوار جذبي را حساب مي كنيم، سطح هر نوار جذبي متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبي يعني حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمي است. ولي امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. مي توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يك دستور ساده قابل تبديل بهم هستند. روش رسم منحني را انجام مي دهيم. در محور افقي غلظت ها و در محور عمودي AUC . بعد از رسم منحني استاندارد، غلظت مجهول را از روي رسم منحني بدست مي آوريم.

كار عملي تعيين غلظت نمونه آموکسي سيلين

محلول Stock آموكسي سيلين تهيه مي كنيم mg 500 به حجم 500 cc مي رسانيم ،(ml/1cc1) مقاديرcc 2-6 از آموكسي سيلين برداشته، نمونه ها را به حجم 100 مي رسانيم .از هر كدام 30 ميكروليتر به دستگاه تزريق مي كنيم حدود 1.8 دقيقه آموكسي بيرون مي آيد.

منحني استاندارد را طبق گفته رسم مي كنيم و بعد غلظت محلول مجهول را مشخص مي كنيم.

سوال :علت پيک منفي چيست؟

 

 

تفاوت HPLC با GC:

1- چون اغلب مواد آلي ناپايدار و كم فرار هستند. براي كار با GC بايد آنها را به مشتقات فرار تبديل كرد كه ايجاد مشتقات فرار و باقي ماندن جزئي از مصرف مشتق ساز ايجاد پيك هائي مي كند كه نتايج آزمايش را مختل مي سازد حال آنكه جداسازي اين گونه مواد با HPLC به آساني امكان پذير است.

2- دو فاز ثابت و متحرك در HPLC بطور رقابتي عمل مي كنند و جداسازي بوسيله دو فاز انجام مي شود در صورتي كه در GC يك فاز يعني فاز ثابت عمل جداسازي را انجام مي دهد.

3- يكي از مزاياي HPLC وجود دتكتورهاي آنست كه براي هر دسته از تركيبات دتكتورهاي انتخابي ويژه وجود دارد كه اين تنوع دتكتورها از مزاياي HPLC است. در صورتي كه در GC دتكتور ها محدود تر مي باشد.

5- مدت آناليز در HPLC فوق العاده اندك است، آناليز تركيبات آلي ناپايدار و كم فرار مواد خوراكي، شيميايي داروئي توسط HPLC امكان پذير است.

6- مواد بسيار قطبي را با GC نمي توان آناليز كرد در صورتي كه با HPLC مي شود.

7- در HPLC به سبب دو فاز رقابتي پيك ها معمولا بصورت متقارن هستند در صورتي كه در GC اغلب پيك ها بصورت نامتقارن هستند و محاسبه مساحت زير منحني يا AUC با اشكال و خطا است. ولي در HPLC بعلت وجود تقارن محاسبه AUC دقيق انجام مي شود.

8- وجود آب در نمونه هاي آزمايش در HPLC اشكال ايجاد نمي كند در صورتي كه در GC وجود اندك آب سبب تخريب دتكتور مي شود.

9- وجود آب در شبكه كريستالي، وجود مولكولهاي آب ئيدروژن در HPLC قابل تشخيص ولي در GC قابل ارزيابي نيست.

10- وجود ناخالص ها بخصوص ناخالصي هاي بسيار قطبي و يا با وزن مولكولي بالا در HPLC قابل تشخيص ولي در GC قابل تشخيص نيست.

 

 

 

مقايسه حوزه كاركرد، محدوديت ها و امتيازات سيستم GC و HPLC

GC HPLC

1- تركيبات آلي بسيار ناپايدار را نمي توان مستقيما مورد آناليز قرار داد و بايد توسط معرفهاي خاصي، از نظر شيميائي آنها را بصورت تركيبات مناسب براي آناليز با GC در آورد. اين معرفها را تركيبات مشتق ساز مي گويند.

 

2- تركيبات آلي با فراريت اندك را نمي توان مستقيما آناليز كرد و بايد توسط عوامل مشتق ساز آنها را به تركيبات مناسب تبديل نمود.

 

3- آناليز مواد داروئي، خوراكي، صنايع سنگين (مثل پليمرها) و مواد شيمي حياتي به سادگي امكان پذير بوده و مستلزم برنامه بنديهائي با شرايط دشوار و پيچيده است. در هر صورت بهره دهي GC در موارد مزبور چندان رضايت بخش نيست.

 

4- اغلب آناليزهاي GC نيازمند دماهاي زياد است كه كنترل مقدار دماي اپتيمم پارامتر مشكلي بوده و اغلب منجر به ايجاد پيكهاي نامتقارن مي شود.

 

5- در سيستم GC فاز ثابت و فاز متحرك با مكانيسم رقابتي همسان عمل نمي كنند و عمدتا يك فاز (فاز ثابت) موجب جداسازي مي گردد. در قياس با عملكرد رقابتي دو فاز (ثابت و متحرك) HPLC، افت شديدي در كم و كيف آناليز ايجاد مي شود.

6- تركيبات متعددي از گونه هاي مختلف وجود دارند كه سيستم GC قادر به آناليز آنها نيست. آناليز اين اجسام با سيستم HPLC امكان پذير نيست.

 

7- در GC بيشتر سه نوع دتكتور ECD, FID و TCD به كار گرفته مي شود و براي دسته تركيبات خاص دتكتورهاي ويژه اي ابداع نشده است. اين امر يكي از محدوديت هاي بزرگ GC در مقايسه با HPLC است.

 

 

 

8- به كارگيري GC و دست يابي به شرايط لازم و مناسب، دشوار و پيچيده است.

 

9- آناليز كمي اجسام در قياس با HPLC از حساسيت و دقت كمتري برخوردار است.

 

 

10- مواد بسيار قطبي را نمي توان مستقيما تحت آناليز قرار داد.

 

11- روند مشتق سازي براي تبديل مواد آزمايشي به تركيبات مناسب براي آناليز، با مشكلات عديده اي مواجه است.

 

12- باقي ماندن مقادير بسيار اندك عوامل مشتق ساز موجب پيدايش پيكهاي ناخواسته مي گردد كه در نهايت استنتاج پيكهاي حاصل از نمونه آزمايشي را دشوار نموده و يا حتي با پيكهاي مزبور تداخل يافته و تفسير كروماتوگرام را عملا ناممكن مي نمايد.

 

13- به سبب جذب مواد آزمايشي توسط فاز ثابت، اغلب پيكها بصورت نامتقارن ايجاد مي شوند.

 

14- وجود ناخالصي هاي بسيار قطبي، در نمونه آزمايشي قابل تشخيص نيست.

 

15- وجود ناخالصي هائي با وزن ملكولي بسيار بالا قابل تشخيص نيست.

 

16- به سبب عدم مشخص شدن ناخالصي هاي بسيار قطبي و يا با وزن ملكولي بالا، لازم است كه پيش از كروماتوگرافي، توسط افزارهائي نظير UV و IR خلوص مواد آزمايشي تحت بررسي قرار گيرد.

 

17- استناد پذيري قاطع يك پيك به يك جسم امكان پذير نيست (بنا به دلايل بالا)

 

18- عدم وجود تقارن در پيكهاي بدست آمده، محاسبه مساحت سطح زير منحني (AUC) را با اشكالات و خطاهاي فراوان مواجه مي كند و در نهايت دقت آناليز مخدوش مي شود.

 

19- وجود مقادير بسيار اندك آب در نمونه هاي آزمايشي باعث تخريب دتكتور FID و ED مي گردد.

 

20- ملكولهاي آب موجود در شبكه كريستالي اجسام توسط GC قابل ارزيابي نيست.

 

21- ملكولهاي آب واجد بند هيدروژني قابل ارزيابي نيست.

 

22- افت چشم گير كارائي و بهره دهي ستون هاي GC در كاربردهاي زياد موردي معمولي است.

 

23- مدت زمان لازم براي آناليز طولاني است.

 

 

24- كاربرد كروماتوگرافي فرآوري در مقياس وسيع امكان پذير نيست.

 

25- افت ميزان آشكارسازي ستونها در بكارگيري زياد آنها در GC موردي عادي و معمولي است.

 

26- عدم سهولت تجديد پذيري و دشواري خاص آن به لحاظ پارامترهاي مختلف جزو محدوديت هاي سيستم GC است. 1- تركيبات آلي بسيار ناپايدار به سادگي تحت آناليز قرار مي گيرند.

 

 

 

 

 

2- تركيبات آلي كه به طور كافي فرار نمي باشند به راحتي مورد آناليز قرار مي گيرند.

 

 

3- آناليز مواد داروئي، خوراكي، صنايع سنگين و مواد شيمي- حياتي با بهره دهي و كارايي بسيار برجسته و چشم گير انجام پذيرست.

 

 

 

 

4- آناليزهاي HPLC در دماي معمولي انجام پذير بوده و يا نيازمند دماهاي اندكي است.

 

 

 

5- در سيستم HPLC دو فاز ثابت و متحرك با مكانيسم رقابتي عمل مي كنند كه در مقايسه با يك فاز موجود در GC (فاز ثابت) موجب انجام آناليزهاي دقيق مي گردند.

 

 

6- تركيبات مختلفي كه آناليز آنها توسط GC امكان ناپذيرست با HPLC به راحتي آناليز مي گردند.

 

 

7- در سيستم HPLC براي هر دسته تركيبات خاص، دتكتورهاي انتخابي ويژه وجود دارد كه كم و كيف آناليز را به بهترين وجه ممكن افزايش مي دهند وجود اين چنين دتكتورهاي انتخابي، فراز عمده اي در سيستم HPLC محسوب مي شود. (توضيح بيشتر دتكتورهاي HPLC در صفحات بعد درج شده است.

 

8- به كارگيري HPLC بسيار آسان است.

 

 

9- آناليز كمي اجسام با حساسيت و دقت فوق العاده اي امكان پذيرست (به علت افزارمندي خاص HPLC)

 

10- مواد بسيار قطبي به راحتي تحت آناليز قرار مي گيرند.

 

11- به علت حوزه وسيع كارائي HPLC معمولا به روند مشتق سازي نيازي نيست.

 

 

12- به علت به كارگيري مواد آزمايشي بدان صورتي كه وجود دارند و نيز به سبب عدم نياز به روند مشتق سازي و عدم وجود بقاياي بسيار اندك عوامل مشتق ساز، استنتاج كروماتوگرام به راحتي انجام مي گيرد.

 

 

13- به سبب وجود دو فاز رقابتي معمولا پيكها بصورت متقارن ايجاد مي شوند.

 

 

14- وجود هرگونه ناخالصي با قطبيت هاي مختلف، قابل تشخيص است.

 

15- وجود ناخالصي هائي با وزن ملكولي بسيار بالا قابل تشخيص است.

 

16- به سبب مشخص شدن هرگونه ناخالصي نيازي به استفاده از افزارهاي UV و IR جهت تعيين خلوص جسم وجود ندارد.

 

 

 

17- بنا به دلايل بالا استناد قطعي يك پيك به جسم خاصي امكان پذيرست.

 

18- به علت وجود تقارن در پيكها، محاسبه دقيق (AUC) و بالمال ارزيابي كمي بسيار دقيق آنها امكان پذيرست.

 

 

19- وجود آب در نمونه هاي آزمايشي اشكالي در كل آناليز ايجاد نمي كند.

 

 

20- ملكولهاي آب موجود در شبكه كريستالي اجسام قابل ارزيابي است.

 

21- ملكولهاي آب واجد بند هيدروژني قابل ارزيابي است.

 

22- كارائي ستونهاي HPLC در بكارگيري هاي فراوان افت قابل توجهي نمي يابند.

 

 

23- مدت زمان لازم براي آناليز بسيار اندك است.

 

24- كاربرد كروماتوگرافي فرآوري در مقياسهاي وسيع امكان پذيرست.

 

25- قدرت آشكارسازي بيشتر ستونها حتي در صورت به كارگيري بسيار زياد آنها جزو امتيازات چشم گير سيستم HPLC است.

 

26- سهولت تجديد پذيري (Reproducibility) در سيستم HPLC از فزارهاي عمده اين سيستم محسوب مي شود.